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Enzymkinetik
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Enzymkinetik
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Protokoll 10.11.2020 Despina Georgiadou Team 9Kinetik des Enzyms Lactatdehydrogenase
Enzyme sind hochspezifische Biokatalysatoren, die einzelne Stoffwechselreaktionen
beschleunigen, indem sie die Aktivierungsenergie senken.
NAD+/NADH ist ein Coenzym, das sich vom Niacin ableitet. Es gehört zur Gruppe der
Redoxcoenzyme und nimmt an enzymkatalysierten Redoxreaktionen teil.
Mit diesem Versuch werden Daten erhoben, mit denen das Enzym Lactatdehydrogenase
(LDH) und NADH charakterisiert werden können.
Wir haben diese Redoxreaktion untersucht, die für die anaerobe Energiegewinnung im
Muskel eine bedeutende Rolle spielt:
LDH
Pyruvat + NADH + H+ ⇌ L-Lactat + NAD+
Am Ende der Glykolyse katalysiert das Enzym LDH die Umwandlung des Substrats Pyruvat in
das Produkt Lactat. Infolgedessen wird das NAD+ recycelt und die Glykolyse kann unter
Anreicherung von Laktat für eine lange Zeit stattfinden.
Gemessen wird hierbei die Extinktionsänderung ΔE340 im Photometer. Diese Werte werden
jeweils in Relation zu der NADH-Konzentrationsänderung gestellt. Anhand derer kann die
Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.
Das Prinzip der Messmethode basiert auf dem optischen WARBURG-Test (UV-
Spektrometrie). Dies nutzt die Tatsache, dass NADH elektromagnetische Strahlung mit einer
Wellenlänge von 340 nm absorbiert, während die oxidierte Form NAD+ dies nicht tut. Je
mehr Pyruvat durch LDH in Lactat umgewandelt wird, desto mehr NADH wird zu NAD+
oxidiert, desto geringer ist die Absorption bei 340 nm. Dies macht sich im Photometer durch
eine Abnahme der Extinktion bemerkbar.
Durchführung:
Geräte: Photometer; Thermostat
Lösungen: 1) bereits angesetzt: Puffer-NADH-LDH-Gemisch im Wasserbad
2) wurde im Praktikum hergestellt: Pyruvat-Stammlösung:
0,093 g Na-Pyruvat mit einem Wägeschälchen wurde abgewogen.
Na-Pyruvat wurde über einen Trichter in einen 10 ml Meßkolben überführt und mit
H2O nachgespült.
Meßkolben wurde mit H2O bis zur Eichmarke aufgefüllt.
Das gelöste Pyruvat wurde in ein Glasgefäß mit Schraubverschluss überführt.
Pyruvat-Verdünnungsreihe 1 - 9 aus der Stammlösung (84 mmol/l) wurden
hergestellt.
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