Wie werden monoklonale Antikörper hergestellt?
1. Hyperimmunisierung: Infizieren eines Wirtsorganismus (z.B. Maus) mit Antigen
2. Fusionieren: B-Zellen (produziert den Antikörper) mit Myelom-Zellen (unsterblich)
3. Kultivierung: in HAT-Medium
4. Tumorzellen und B-Zellen sterben
5. nur die fusionierten Zellen überleben
6. Selektion
7. Subklonierung
Beschreiben sie die Wirkungsweise des HAT-Selektionsmediums zur Kultur von Hybridomazellen.
- HAT-Medium:
- Hyproxanthin: Purinderivat
- Aminopterin: Zellgift: hemmt Biosynthese von Purinen
- Thymidin: dient als Substrat für alternativen Stoffwechsel, wenn das Enzym HGPRT
vorhanden ist
- B-Zellen sind HGPRT positiv, haben aber keine lange Lebenszeit sterben also nach einer
gewissen Zeit
- Myelomzellen sind HGPRT negativ, haben also keine alternativen Stoffwechselweg zur
Purinsynthese
- Es überleben also nur die Fusionszellen, da diese langlebig sind und HGPRT positiv
Was ist der Unterschied zwischen embryonalen Stammzellen, adulten Stammzellen und induzierten
pluripotenten Zellen?
- Embryonale Stammzellen: befinden sich in der inneren Zellmasse (Blastocysten), erneuern
sich selbst, sind pluripotent (können sich zu jedem Zelltyp differenzieren) und sind
unbegrenzt Teilungsfähig
- Adulte Stammzellen: befinden sich in vielen Geweben, dienen der Erneuerung und Heilung,
sind multipotent (können nur zu Zelltypen innerhalb des Gewebes differenzieren) und ihre
Eigenschaften variieren zwischen unterschiedlichen Geweben
- Induzierte pluripotente Zellen: Werden durch direkte Transformation aus adulten
Körperzellen gewonnen (dafür reicht die Expression von 3 Genen) und ähneln adulten
Stammzellen, sind pluripotent
Was sind IPS-Zellen und wie können sie in vitro erzeugt werden?
- = Induzierte Pluripotente Stammzellen
- induzierte pluripotente Stammzellen: werden durch direkte Transformation aus adulten
Stammzellen gewonnen
Welche Funktion hat der Teratom-Assay und wie wird er durchgeführt?
- um herauszufinden, ob Zellen pluripotent sind
- Die zu beurteilenden Zellen werden in immunsupprimierte Maus injiziert, wo sich ein
Teratom bildet, das entfernt und histolodisch untersucht wird, sobald es eine angemessene
Größe erreicht hat
, Von welchen Faktoren hängt der Schmelzpunkt eines Nukleinsäure-Hybrides in wässriger Lösung
ab?
- GC-Gehalt
- Länge des Hybrids
- Konzentration Formamid
- Komplementarität (je miss-match singt Schmelztemperatur um 1°C)
Welche Funktion haben Transient Amplifying Cells?
- Transient Amplifying Cells sind teilungsfähige Vorläuferzellen, die die Nachkommenschaft der
Stammzellen vergrößert, ohne das Teilungspotenzial der Stammzelle selbst zu strapazieren.
Sie entsteht aus Teilung einer Stammzelle
- Eine Tochterzelle bleibt Stammzelle, die andere bleibt die Vorläuferzelle
Wie gehen sie bei der Reinigung eines Enzyms aus einem Pilz vor? Beginnen sie mit dem intakten
Organismus und nennen sie 2 Zellaufschlussmethoden und 4 Möglichkeiten das Enzym anzureichern.
- Zellaufschlussmethoden: z.B. Kugelmühle: Probe wird mit Glaskügelchen in Stahlzylinder
eingefroren geschüttelt; z.B. Frechpress
- Anreicherung: pH- Fällung, Ammoniumsulfat-Fällung, Immunopräzipitation, Mikrofiltration
Wie verändert sich die Aktivität, wie die spezifische Aktivität während der Aufreinigung?
- Während der Proteinaufreinigung verringert sich Proteinmenge, dadurch auch die
Enzymaktivität, aufgrund der Reinigungsschritte
- spezifische Aktivität steigt dabei, da durch Aufreinigung das gesuchte Protein angereichert
wird
Wie können Sie, ausgehend von einem gereinigten Enzym, das entsprechende Gen klonieren?
Beschreiben sie eine Methode, mit der Sie die Interaktion von zwei Proteinen in der lebenden Zelle
visualisieren können.
- FRET
- Beide Proteine sind fluoreszentzmakiert und wenn Proteine sich annähern, auf einen
Abstand von 10 nm, interagierten sie miteinander. 1. Protein gibt Fluoreszenz an 2.
Protein weiter und man sieht nur 2. Protein
Sie haben in einer Proteom-Analyse bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae mittels 2D
Gelelektrophorese ein Protein Identifiziert, das während der Sporulation stark exprimiert wird. Wie
können Sie herausfinden, um welches Protein es sich handelt?
- Peptide Massfingerprinting: isoliertes Protein wird genommen, mit Trypsin verdaut und ist
für jedes Protein charakteristisch, Genom ist bekannt
- Gesamtes Proteom wird virtuell verdaut
- tryptische Verdaustücke werden im Massenspektrometrie untersucht und mit Proteom
verglichen
- Durch Peaks werden gleiche Peptidmuster erkannt, geben Rückschluss auf Gen
Nennen sie 2 Eigenschaften eines Proteins, die zur Trennung von anderen Proteinen verwendet
werden können.
- Größe, Ladung
, Nennen sie 4 Methoden, mit denen man Proteine aufreinigen kann.
- Gelfiltration (Ausschlusschromatographie)
- Affinitätschromatographie
- Isoelektrische Fokussierung (IEF)
- Ionenaustauschchromatographie (IEX)
Nennen Sie 2 Isotope in der Biologie und wie sie nachgewiesen werden können.
- Deuterium, Tritium
- Röntgenfilm, Szintillationszähler
Beschreiben sie das Yeast two Hybrid System:
- Nachweis für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Hefe
- Hybridprotein aus zwei verschiedenen Domänen aus jeweils zwei Hefen
- Plasmid1 codiert für GAL4-BD (Köderprotein), an die eine Aminosäuresequenz bindet
- Plasmid2 codiert für GAL4-AD (Beuteprotein), welches sich dann zum Hybridprotein
zusammensetzt
Beschreiben sie das pET System in seiner einfachsten Form:
- Positronen-Emissions-Tomographie
- Radionuklid zerfällt in Positron und trifft auf Elektron (im jeweiligen Gewebe) = Annihilation
- Zwei Photonen (Gammastrahlung) entstehen und entfernen sich mit 180° zueinander
- Detektoren erfassen Photonen und kann rechnerisch ein Positronenemission ermittelt
werden
Nennen und erklären sie eine Methode, um Protein-Protein Interaktion in vivo nachzuweisen
- BIFC: Beide Proteine werden mit nicht-intakten Fragmenten eines Fluoreszenzfarbstoffs
versehen, die bei Interaktion durch Zusammenlagerung zu einem intakten fluoreszierenden
Komplex werden
- FRET: Donorfarbstoff überträgt Energie strahlungslos auf Akzeptorfarbstoff bei Interaktion
Sie haben einen Vektor für die Hefe der a) das URA3 Gen als Selektionsmarker enthält, und b) einen
Bereich mit ihrem Lieblingsgen (YFG). Beschreiben Sie, wie Sie bei der Transformation den Vektor
gezielt in YFG-Gen der Hefe integrieren können.
Beschreiben sie eine Methodik, mit der man in der Maus- Zelllinie nach der Transformation solche
Zellen anreichern kann, in denen die transformierte DNA über homologe Rekombination eingebaut
wurde. Welche Zelllinien würden sie verwenden, wenn Sie damit eine Knockout-Maus generieren
wollten?
- Verwendung einer DNA-Sequenz mit zum Zielgen homologer Bereiche
- Markergen unterbricht Sequenz und wird durch homologe Rekombination eingebaut
- Aus Blastozysten werden embryonale Stammzellen entnommen und transformiert
- Wenn Knockout funktioniert hat werden Zellen vermehrt, wieder in eine Blastozyste
eingesetzt und einer Maus implantiert
