1. Wat bepaald het oplossend vermogen van een microscoop? Vergelijk
lichtmicroscopie (LM) met elektronenmicroscopie (EM)! En wat betekent ‘praktische
resolutie?
Het oplossende vermogen van een microscoop (de resolutie) wordt gedefinieerd als de
kleinste afstand tussen twee punten die nog net gescheiden kunnen worden waargenomen.
Het oplossend vermogen is vooral afhankelijk van het objectief en in mindere mate van de
consensor, terwijl het oculair niet veel bijdraagt. De beeldkwaliteit wordt bepaald door de
kleurweergave, de transparantie, het contrast en de resolutie van de lenzen en het afwezig
zijn van artefacten, terwijl de eigenschappen van het preparaat ook belangrijk zijn. De
praktische resolutie is de resolutie met de hoogste vergroting waarbij men nog steeds een
scherp beeld heeft. Een goede beeldinformatie wordt verkregen wanneer vergroting en
resolutie in evenwicht zijn. Een belangrijke specificatie van het objectief is de numerieke
apertuur (NA), voornamelijk bepaald door de tophoek van de lichtkegel die door een objectief
kan worden opgenomen. Met licht van 550 nm en een NA van 1.40 zal de resolutie van een
objectief 0,25 µm benaderen. Dit is de grens van LM; kleinere details kunnen niet
gescheiden worden waargenomen met een conventionele LM. Met dit oplossend vermogen
kan met nog net organellen in een cel zien als de coupe van goede kwaliteit is. De
specificaties van een objectief lens staan meestal op de zijkant gegraveerd. Daar vinden we
de waarden voor de vergroting (2 – 100x), de NA (voor LM maximaal 1.40), de tubul lengte
(160 mm, 170 mm of infinity) en de correctie voor de dekglasdikte (0,17 mm). De maximale
resolutie bij EM is +/- 0,1 nm. Hierdoor kunnen er meer en kleinere structuren worden
waargenomen. Uiteindelijk gaat het bij de resolutie van microscopen hierom: De resolutie en
het scanformaat zijn omgekeerd evenredig met elkaar (R = (K x ) / NA) . Hoe hoger de
resolutie wordt ingesteld, hoe kleiner het gebied dat kan worden “gescand”. En ook
omgekeerd, hoe groter het “scangebied” hoe lager de resolutie kan worden ingesteld.
Verschil in bouw
,2. In de routine histopathologie is de HE kleuring zeer courant. Hoe prepareer je een
weefselbiopt en waarop is de HE kleuring gebaseerd?
Weefselvoorbereiding wordt gedaan omdat organen en weefsels slechts zelden zonder
voorbereiding met een microscoop kunnen worden onderzocht. Weefselvoorbereiding
bestaat uit 4 stappen: Fixatie, inbedding, snijden en opvangen, en kleuring.
Fixatie
Fixatie stopt het metabolisme van cellen en weefsels, legt de structuur vast en bereidt voor
op de daarop volgende behandelingen. Het streven is om daarbij artefacten te voorkomen.
De fixatie met chemicaliën houdt het crosslinken, denatureren en onwerkzaam maken van
enzymen, structurele proteïnen en fosfolipiden in. Fixatie dient bij voorkeur op zeer vers
weefsel te gebeuren, omdat door autolyse verval van structuur in weefsel optreedt nadat het
uitgenomen is of van zijn fysiologische ondersteuning ontdaan is. Voor lichtmicroscopie (LM)
is een groot aantal fixatieven in gebruik, bijvoorbeeld Bouin, dat vooral formaldehyde en
picrinezuur bevat. Formaline bestaat uit een verzadigde oplossing van formaldehydegas in
water, ook wel formol genoemd. Fixatieven voor elektronenmicroscopie (EM) bevatten
dikwijls glutaaraldehyde, waarvan de twee aldehyde groepen de NH2-groepen van eiwitten
crosslinken, en een buffer en een stof om het fixatief isotoon te maken ter voorkoming van
volumeveranderingen van cellen. Voor EM wordt vaak gebruik gemaakt van dubbelfixatie.
Hierbij past men na de glutaaradelhyde osmiumtetroxide toe, dat de onverzadigde banden in
vetzuren fixeert en crosslinkt. Fixtatieven kunnen worden toegepast door immersie, waarbij
een stukje weefsel in het fixatief wordt ondergedompeld, of door perfusie van het fixatief via
de bloedvaten in het orgaan.
Inbedding – Snijden en opvangen
Om het weefsel goed te kunnen snijden, moet het worden geïmpregneerd met een vloeibaar
inbedmiddel, dat pas na penetratie verhardt door afkoeling of polymerisatie. De inbedding
wordt meestal voorafgegaan door een dehydratie in een graduele alcoholserie van 30 tot
100%. Hierna wordt een lipidenoplossing (zoals xyleen of chloroform) toegepast, van waaruit
het weefsel voor LM met vloeibare paraffine bij 60°C wordt geïmpregneerd. Door afkoeling
stolt de paraffine en kan het weefsel met een scherp stalen mes in een microtoom worden
gesneden tot coupes van ongeveer 5 µm dik. De coupes worden gestrekt op warm water,
gemonteerd op objectglaasjes, gedeparaffineerd, gekleurd en onder een dekglaasje
ingesloten. Voor EM wordt een hardere inbedding met epoxyharsen gebruikt om het snijden
van dunnere coupes mogelijk te maken. Het weefsel wordt na de dehydratie overgebracht in
een plastic monomeer, waarna een chemische polymerisator het plastic in twee dagen
verhardt. Ultra dunne coupes voor EM, met een dikte van 50 tot 100 nm, worden gesneden
op een ultramicrotoom met een glazen of diamanten mes. De coupes worden opgevangen
op een wateroppervlak dat aansluit op de mesrand. De drijvende coupes worden opgevist op
een klein metalen roostertje (grid), dat als preparaatdrager dienst doet. Door contact met een
druppel waarin lood- of uranylionen aanwezig zijn worden de coupes gecontrasteerd, zodat
ze in een transmissie-EM (TEM) bestudeerd kunnen worden.
Kleuring
Coupes die met een microtoom (LM) worden gesneden, hebben van nature weinig contrast
om ze direct te kunnen bestuderen. Daarom worden ze gekleurd. Doordat kleurstoffen aan
verschillende componenten van cellen verschillend sterk absorberen, komen kleurverschillen
tot stand. Deze kleurverschillen maken de structuren van cellen duidelijk. De HE-kleuring
(hematoxyline-eosine-kleuring) met een combinatie van donkere kernen en roze cytoplasma
is een standaard kleuring in de histologie. Weefselbestanddelen zoals de basofiele
nucleïnezuren (DNA en RNA), kleuren paarsblauw door de basische kleurstof hematoxyline.
Eosine is een zure kleurstof die voornamelijk basische componenten zoals de NH2-groepen
van eiwitten roze aankleurt. Deze componenten worden ook wel acidofiel of eosinofiel
genoemd. Andere veel gebruikte kleuringen voor LM zijn: AZAN, PAS, Orceïne en
, Trichroom. Bij EM worden en geen kleuringen gebruikt, maar wordt er doormiddel van
uranylacetaat of loodnitraat contrast aangebracht in de coupes.
Haematoxyline Eosine Y
lichtmicroscopie (LM) met elektronenmicroscopie (EM)! En wat betekent ‘praktische
resolutie?
Het oplossende vermogen van een microscoop (de resolutie) wordt gedefinieerd als de
kleinste afstand tussen twee punten die nog net gescheiden kunnen worden waargenomen.
Het oplossend vermogen is vooral afhankelijk van het objectief en in mindere mate van de
consensor, terwijl het oculair niet veel bijdraagt. De beeldkwaliteit wordt bepaald door de
kleurweergave, de transparantie, het contrast en de resolutie van de lenzen en het afwezig
zijn van artefacten, terwijl de eigenschappen van het preparaat ook belangrijk zijn. De
praktische resolutie is de resolutie met de hoogste vergroting waarbij men nog steeds een
scherp beeld heeft. Een goede beeldinformatie wordt verkregen wanneer vergroting en
resolutie in evenwicht zijn. Een belangrijke specificatie van het objectief is de numerieke
apertuur (NA), voornamelijk bepaald door de tophoek van de lichtkegel die door een objectief
kan worden opgenomen. Met licht van 550 nm en een NA van 1.40 zal de resolutie van een
objectief 0,25 µm benaderen. Dit is de grens van LM; kleinere details kunnen niet
gescheiden worden waargenomen met een conventionele LM. Met dit oplossend vermogen
kan met nog net organellen in een cel zien als de coupe van goede kwaliteit is. De
specificaties van een objectief lens staan meestal op de zijkant gegraveerd. Daar vinden we
de waarden voor de vergroting (2 – 100x), de NA (voor LM maximaal 1.40), de tubul lengte
(160 mm, 170 mm of infinity) en de correctie voor de dekglasdikte (0,17 mm). De maximale
resolutie bij EM is +/- 0,1 nm. Hierdoor kunnen er meer en kleinere structuren worden
waargenomen. Uiteindelijk gaat het bij de resolutie van microscopen hierom: De resolutie en
het scanformaat zijn omgekeerd evenredig met elkaar (R = (K x ) / NA) . Hoe hoger de
resolutie wordt ingesteld, hoe kleiner het gebied dat kan worden “gescand”. En ook
omgekeerd, hoe groter het “scangebied” hoe lager de resolutie kan worden ingesteld.
Verschil in bouw
,2. In de routine histopathologie is de HE kleuring zeer courant. Hoe prepareer je een
weefselbiopt en waarop is de HE kleuring gebaseerd?
Weefselvoorbereiding wordt gedaan omdat organen en weefsels slechts zelden zonder
voorbereiding met een microscoop kunnen worden onderzocht. Weefselvoorbereiding
bestaat uit 4 stappen: Fixatie, inbedding, snijden en opvangen, en kleuring.
Fixatie
Fixatie stopt het metabolisme van cellen en weefsels, legt de structuur vast en bereidt voor
op de daarop volgende behandelingen. Het streven is om daarbij artefacten te voorkomen.
De fixatie met chemicaliën houdt het crosslinken, denatureren en onwerkzaam maken van
enzymen, structurele proteïnen en fosfolipiden in. Fixatie dient bij voorkeur op zeer vers
weefsel te gebeuren, omdat door autolyse verval van structuur in weefsel optreedt nadat het
uitgenomen is of van zijn fysiologische ondersteuning ontdaan is. Voor lichtmicroscopie (LM)
is een groot aantal fixatieven in gebruik, bijvoorbeeld Bouin, dat vooral formaldehyde en
picrinezuur bevat. Formaline bestaat uit een verzadigde oplossing van formaldehydegas in
water, ook wel formol genoemd. Fixatieven voor elektronenmicroscopie (EM) bevatten
dikwijls glutaaraldehyde, waarvan de twee aldehyde groepen de NH2-groepen van eiwitten
crosslinken, en een buffer en een stof om het fixatief isotoon te maken ter voorkoming van
volumeveranderingen van cellen. Voor EM wordt vaak gebruik gemaakt van dubbelfixatie.
Hierbij past men na de glutaaradelhyde osmiumtetroxide toe, dat de onverzadigde banden in
vetzuren fixeert en crosslinkt. Fixtatieven kunnen worden toegepast door immersie, waarbij
een stukje weefsel in het fixatief wordt ondergedompeld, of door perfusie van het fixatief via
de bloedvaten in het orgaan.
Inbedding – Snijden en opvangen
Om het weefsel goed te kunnen snijden, moet het worden geïmpregneerd met een vloeibaar
inbedmiddel, dat pas na penetratie verhardt door afkoeling of polymerisatie. De inbedding
wordt meestal voorafgegaan door een dehydratie in een graduele alcoholserie van 30 tot
100%. Hierna wordt een lipidenoplossing (zoals xyleen of chloroform) toegepast, van waaruit
het weefsel voor LM met vloeibare paraffine bij 60°C wordt geïmpregneerd. Door afkoeling
stolt de paraffine en kan het weefsel met een scherp stalen mes in een microtoom worden
gesneden tot coupes van ongeveer 5 µm dik. De coupes worden gestrekt op warm water,
gemonteerd op objectglaasjes, gedeparaffineerd, gekleurd en onder een dekglaasje
ingesloten. Voor EM wordt een hardere inbedding met epoxyharsen gebruikt om het snijden
van dunnere coupes mogelijk te maken. Het weefsel wordt na de dehydratie overgebracht in
een plastic monomeer, waarna een chemische polymerisator het plastic in twee dagen
verhardt. Ultra dunne coupes voor EM, met een dikte van 50 tot 100 nm, worden gesneden
op een ultramicrotoom met een glazen of diamanten mes. De coupes worden opgevangen
op een wateroppervlak dat aansluit op de mesrand. De drijvende coupes worden opgevist op
een klein metalen roostertje (grid), dat als preparaatdrager dienst doet. Door contact met een
druppel waarin lood- of uranylionen aanwezig zijn worden de coupes gecontrasteerd, zodat
ze in een transmissie-EM (TEM) bestudeerd kunnen worden.
Kleuring
Coupes die met een microtoom (LM) worden gesneden, hebben van nature weinig contrast
om ze direct te kunnen bestuderen. Daarom worden ze gekleurd. Doordat kleurstoffen aan
verschillende componenten van cellen verschillend sterk absorberen, komen kleurverschillen
tot stand. Deze kleurverschillen maken de structuren van cellen duidelijk. De HE-kleuring
(hematoxyline-eosine-kleuring) met een combinatie van donkere kernen en roze cytoplasma
is een standaard kleuring in de histologie. Weefselbestanddelen zoals de basofiele
nucleïnezuren (DNA en RNA), kleuren paarsblauw door de basische kleurstof hematoxyline.
Eosine is een zure kleurstof die voornamelijk basische componenten zoals de NH2-groepen
van eiwitten roze aankleurt. Deze componenten worden ook wel acidofiel of eosinofiel
genoemd. Andere veel gebruikte kleuringen voor LM zijn: AZAN, PAS, Orceïne en
, Trichroom. Bij EM worden en geen kleuringen gebruikt, maar wordt er doormiddel van
uranylacetaat of loodnitraat contrast aangebracht in de coupes.
Haematoxyline Eosine Y
