Exam (elaborations)
volledige samenvatting van de lessen en antwoorden op oude examenvragen van flowcytometrie
- Course
- Institution
volledige samenvatting van de lessen en antwoorden op oude examenvragen van flowcytometrie
[Show more]
Seller
Follow
lemmeslodders
Reviews received
Content preview
Examenvragen Flowcytometrie• Bespreek celsorter, en kan je water gebruiken als geleidingsvloeistof?
Een celsorter kan cellen die een gewenste eigenschap/parameter vertonen sorteren.
De celsuspensiestraal zal zich opbreken in druppels volgens de Rayleigh theorie. Er wordt een
natuurlijke opbreekfrequentie opgelegd m.b.v. een ultrasone transducer. Na de afbuigingswachttijd (Tijd
tussen detectie cel en haar verschijnen in de afbrekende druppel) wordt de op dat moment afbrekende
druppel opgeladen en dan door een hoogspanningsveld gestuurd waar het zal afbuigen afhankelijk van
de lading en waar collectie plaats vindt.
Water kan gebruikt worden als geleidingsvloeistof omdat dit lamellaire stroming kan hebben en zich niet
met de celsuspensievloeistof mengt.
• Wat zijn intracellulaire antigenen? Wat is het verschil met membraangebonden antigenen en
wat zijn de eventuele moeilijkheden?
Intracellulaire antigenen zijn antigenen die zich niet op het celmembraan bevinden maar in de cel
zelf. Voor intracellulaire antigenen moet het membraan eerst permeabel gemaakt worden, en
moeten de cellen eventueel eerst gefixeerd worden. Door het fixeren/permeabiliseren verliest men
lichtsverstrooingsinformatieinhoud en ligt de signaal-ruisverhouding lager.
• Leg uit wat flowcytometrie is en aan welke voorwaarden het moet voldoen
Flowcytometrie is de detectie van lichtsignalen opgewekt door een snelle doorgang van afzonderlijke
cellen door een centrum van een, tot een microscopisch kleine spot gefocuseerde, lichtstraal. Dit
wordt mogelijk gemaakt door de hydrodynamische focusering van de celsuspensiestroom in een
laminaire geleidingsvloeistofstroom.
Het moet aan de volgende voorwaardes voldoen:
Cel of partikel grootte moet 0.2 micrometer tot 150 micrometer zijn. (Leukocyt goed voorbeeld,
celaggregraten zoals tumoren/weefsels niet. Moeten enzymatisch/mechanisch los gemaakt worden)
Geleidingsvloeistof moet voldoen aan getal van Reynolds voor laminaire stroming dus <2300 (Formule en
parameters erbij geven = extra punten) -> = / met d = tube diameter, p = dichtheid vloeistof, v =
GEMIDDELDE snelheid vloeistof en η = viscositeit vloeistof.
• Verklaar volgende begrippen in 3 zinnen:
o FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer. Het emissiespectra van een donormolecuul overlapt met
het excitatiespectra van een acceptormolecuul waardoor de acceptor geëxciteerd wordt.
o FMIA
Fluorescence Microsphere Immuno Assay. Kwantificatie van verschillende cytokines in het supernatans
van geactiveerde celpopulaties in 1 enkel staal door antilichaam op plastic pareltjes te binden en in
analietmonster toe te voegen, en hierna chromofoor-gekoppeld anti-analiet antilichaam toe te voegen. o
PhiPhiLux
Caspase-3 activiteit dat fluoresceert bij enzymatische klieving. Meet hoe een eiwit wordt afgebroken.
, • Bespreek hydrodynamische focusering
Celsuspensie wordt geinjecteerd in een geleidingsvloeistof met laminaire stroming, de celsuspensie heeft
een hogere druk. De twee vloeistoffen mengen niet, en door de hogere druk van de celsuspensie en de
laminaire stroming van de geleidingsvloeistof zullen de cellen in 1 smalle lijn aan constante snelheid van
10m/s door de laserbundel vervoerd worden.
• Wat zijn de voordelen van flowcytometrische analyses t.o.v. klassieke bulk methodes? Klassieke
bulk methodes nemen vooral gemiddelde waardes als meetmethode en analyseren vaak 1
parameter bij een homogene celsuspensie, terwijl FCM een cel-per-cel meetmethode (single-
cell resolutie) heeft en zeer snel volledige parameterdistributies kan genereren voor meerdere
parameters op een statistisch relevant aantal cellen van een heterogene celsuspensie.
• Proliferatieve technieken:
Er zijn 2 technieken om de cellulaire proliferatie technieken over meerdere dagen te volgen. a.
BrdU hoechst fluorescentie
Techniek waarbij BrdU geïncorporeerd wordt in het membraan, de fluorescentie gaat dalen
naarmate er meer DNA in de cellen zit. onderscheiden 3 opeenvolgende celcycli
b. Chromofore moleculen
Blijven ofwel verankerd in het celmembraan of in het cytoplasma en vormen celtrackers. Zo
kan je de celdelingen volgen de dochtercellen zullen maar de helft van de fluorescentie
vertonen als de moedercel. ( tot 6 cycli waarneembaar)
(lipofiele moleculen of ongeladen moleculen)
• Wat is het verschil tussen ADC van vroeger en van nu? Max 3 zinnen
Analog-to-Digital Converters van vroeger gingen maar tot 10 bit en dus 1024 kanalen. De ADC’s
van tegenwoordig hebben een veel hogere resolutie omdat deze meer bit hebben. Ook verschuift
het moment van conversie.
ADC vroeger:
ADC Nu:
PMT preamp ADC tresholding en signal processing computer
• Bespreek EFGP en CBA
Voor CBA oftewel Cytometric Bead Array zie FMIA, zelfde principe.
EFGP staat voor Enhanced Green Fluorescent Protein. Dit is een gehumaniseerde en roodverschoven
mutant van het Green Fluorescent Protein met intrinsieke groene fluorescentie. Door deze in te
bouwen voor het stopcodon van een getransfecteerd gen kan gekeken worden naar de genexpressie en
de mate hiervan.
• Hoe wordt de caspase activiteit van apoptotische cellen gedetecteerd?
, D.m.v. caspase substraten (bv. Phiphilux) die AZ-sequenties bevatten (bv. DEVDGI) dat herkend wordt
door caspase 3 fluorescentie t.g.v. caspase gemedieerde klieving.
Eerst wordt een probe toegevoegd aan cellen en hierna wordt Caspase 3 geactiveerd. Hierna door Laseruv
licht emissie-fluorescentie van blauwlicht.
Via GFP en CFP:
Apoptose; groene fluorescentie daalt
Geen apoptose: groene fluorescentie blijft
Annexine-5 is een apoptosemerker die bindt op phospatidylserine aan de buitenkant van het
membraan wat op apoptose duidt.
• Wat zijn de algemene eigenschappen van probes voor intracellulaire activiteit? Geef een
voorbeeld
• Fluorescente probes moeten membraanpermeabel zijn (d.m.v. esters) , en moeten vrij in het
cytoplasma blijven. De fluorescente probes moeten gehydrolyseerd worden door intracellulaire
esterases om zo een ionair karakter te krijgen, zo zullen zij niet uit de cel geraken. Ze moeten
een vlugge respons hebben op transiënte veranderingen, en geen interferentie met de te
sonderen respons of met andere celfuncties vertonen. Een voorbeeld is bijvoorbeeld Indo-1, een
Ca2+ probe.
• Leg uit: Stoke’s shift
Het verschil tussen de laagste absorptie energiepiek en de hoogste fluorescentie-emissie energiepiek.
Indien men tegelijkertijd meerdere cellulaire constituenten wil evalueren met 1 laser, wordt er
gebruikt gemaakt v/e specifieke probe waarvan de chromofore groepen kenmerkt worden door een
zelfde golflengte maximum in hun absorptiesepctra maar een verschillende golflengte maximum in hun
fluorescentiespectra.
• Waarom zit er een wachttijd bij de celsorter?
De wachttijd wordt experimenteel bepaald en is de tijd die verloopt tussen de detectie van de cel ter
hoogte van de laserinterceptie, en het verschijnen van die cel in de in de vloeistofstraal afbrekende
druppel. Deze wachttijd zit er omdat zo exact de cellen die nodig zijn opgeladen kunnen worden voor het
verdere sorteren.
• Wat is TUNEL?
Terminal deoxynucleotide transferase biotin DVTP nick end labeling. Het labelen van DNA eiwitten na
een breuk door terminal transferase gemedieerde incorporatie van fluorescente nucleotiden
ingebouwd = DNA degradatie meten. Hierna DNA fragmentatie detecteren door de uiteinden te
labelen.
• Hoe kun je cytokines aantonen?
Via CBA, FMIA of probes:
Op plastieke pareltjes wordt een antistof gehecht dmv adhesie om analieten te bepalen. De
verkregen capture beads worden toegevoegd aan het monster waarin we de analiet willen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lemmeslodders. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.65. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
52510 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now