Alle hoorcolleges samenvatting DT2
Griffiths H10: Gene isolation and manipulation
Griffiths H14: Genomes and genomics
Morris H21: Population Genetics
Morris H22: Speciation / Species, their Formation
Morris H23: Phylogeny and Fossils
Griffiths H20: Evolution of Genes and Traits
Griffiths H...
Samenvatting Genetica en Evolutie DT2
Griffiths H10: Gene isolation and manipulation
De technieken in dit hoofdstuk voorbij komen zijn technieken die onderzoekshypotheses kunnen
testen.
DNA Extractie
Je zoekt in het genoom van een persoon een bekende mutatie in een gen waar we de sequentie van
kennen. Hoe kunnen we testen of iemand die bekende mutatie heeft?
1. DNA-extractie van de familieleden
2. Gebruik PCR (polymerase ketting reactie) om de mutatie te detecteren
DNA-extractie is een proces waarbij je het DNA van iemand afneemt. Eerst neem je bijvoorbeeld
wangslijmcellen af. Deze cellen breek je open door middel van een lysis buffer bij het DNA te voegen
en vervolgens het epje in een warmwaterbad te doen, het DNA is nu vrijgekomen. Dan scheid je het
DNA van eiwitten door middel van een zoutoplossing die zorgt dat de eiwitten bij elkaar klonteren,
vervolgens centrifugeer je het epje en dan pipetteer je de vloeistof met DNA (zonder eiwitten) in een
nieuw epje. De volgende stap is het DNA isoleren, dit doe je door (isopropyl) toe te voegen, daardoor
klontert het DNA bij elkaar. Dan kan je de vloeistof eruit pipetteren en dan blijft er DNA over.
PCR
PCR: De polymerasekettingreactie (polymerase chain reaction), is een manier om uit zeer kleine
hoeveelheden DNA specifiek een of meer gedeeltes te multipliceren (amplificeren) tot er genoeg van
is om het te analyseren.
Stel je hebt een grote mutatie -> deletie/duplicatie ~ 50bp -> dan zet je PCR product op agarose gel.
Stel je hebt een kleine mutatie -> SNP/insertie/deletie -> dan ontwikkel je een selectieve primer voor
de deletie/SNP. Wildtype geen PCR product en mutant wel PCR product, dan zet je PCR fragmenten
op de agarose gel.
De PCR reactie bestaat uit drie fasen:
1. Denaturatie: Door het DNA te verhitten tot tussen de 90 en 96°C gaan de twee strengen uit
elkaar en ontstaan twee matrijzen.
2. Hybridisatie: Vervolgens hechten de primers zich bij een temperatuur tussen de 45 en 65°C
door de langzaam dalende temperatuur aan de twee enkelvoudige DNA-strengen.
3. Elongatie: Bij 72°C wordt door DNA-polymerase de primer richting 5' verlengd, waardoor er
twee stukken dubbele DNA-strengen ontstaan.
(Stap 1 tot 3 herhaling): Nu worden deze stukjes weer door verhitting gesplitst in enkelstrengs-DNA
enz. Daar de aanwezige primers voorkeursparing hebben met de twee enkelstrengs-DNA die een
verlenging zijn van deze primers worden alleen deze DNA-stukken gerepliceerd. Na enkele cycli is er
zo veel DNA aangemaakt dat deze aangetoond kan worden met gelelektroforese.
Een primer is een klein stukje enkelstrengs-RNA of -DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR.
Vanaf de primer wordt het DNA richting 3' gekopieerd. DNA wordt altijd van 5' naar 3' gebouwd.
1
,Er wordt gebruikgemaakt van een thermostabiel polymerase-enzym, zoals Taq-polymerase, dat een
optimale temperatuur van ongeveer 72°C heeft.
Gel elektroforese
Gelelektroforese is een scheidingstechniek die DNA onder invloed van een elektrisch veld laat
bewegen in een gel. Het negatief geladen DNA beweegt zich naar beneden, waar de positieve pool
(anode) zich bevindt. Hoe groter het DNA fragment, hoe trager ze zullen bewegen (migreren); hoe
kleiner het DNA-fragment, hoe sneller ze zullen bewegen.
Je maakt een gel van agarose, vervolgens pipetteer je het DNA gemengd met een kleuring in de
slotjes. Deze gel doe je in de gelelektroforese bak en in de bak doe je ook een bufferoplossing.
Vervolgens zet je spannning op de bak en zal het DNA bewegen in de gel.
We willen een humaan gen in een ander organisme tot expressie brengen, dat organisme is dan een
transgeen organisme. We moeten de eiwit coderende sequentie van de receptor vinden. We zijn
geïnteresseerd in het eiwit dus we isoleren het mRNA. Eerst isoleren we het mRNA uit het weefsel,
vervolgens produceren we selectief het cDNA (dat heet reverse transcriptase). Reverse transcriptase
is een enzym dat RNA in cDNA kan omzetten. (Retrovirussen bevatten een RNA genoom, maar
produceren een DNA kopie die in het genoom van de gastheer kan komen). We kennen de sequentie
van het gen dus we hebben beide primers. De volgende stap is het kloneren van het cDNA in een
geschikt expressie systeem. Dit doe je door restrictie, ligatie en vervolgens kloneren. Restrictie is als
een enzym een specifiek stuk DNA knipt. Ligatie is als ligase twee DNA strengen weer aan elkaar
maakt. Om het DNA van een organisme in een ander organisme te krijgen heb je een vector nodig.
Om ons cDNA in een expressie vector te kloneren maken we zogenaamde ‘sticky ends’. Dit kan op
twee manieren. Ten eerste kan je een speciale PCR primer gebruiken om aan je gekloneerde DNA
sticky ends te maken. Ten tweede kan je adapters ligeren die de gewenste restrictie sites bevatten
aan je cDNA (‘linkers’). Transfectie is het inbrengen van DNA uit een ander organisme in een
organisme.
Microarray
We willen het verschil in genexpressie tussen twee organismen vergelijken.
Als het eerste zal je mRNA moeten extracten, daarna zal er cDNA synthese moeten plaatsvinden (met
reverse transcriptase). Dan moet het cDNA gelabeld worden met fluorescente kleuring. En
vervolgens kan je gebruik maken van de techniek Microarray.
2
,De microarray plaat bestaat uit heel veel spots, aan deze spots zitten probes vastgehecht. Dit zijn de
genen waar men voor heeft gekozen om onderzoek naar te doen. (Een probe is een klein stukje DNA
of RNA waarmee op basis van zijn nucleotide samenstelling door middel van hybridisatie een
specifiek DNA- of RNA fragment herkend kan worden. Door de probe te labelen kan het DNA-RNA
fragment gedetecteerd worden.) Deze twee gelabelde cDNA-producten die je wilt vergelijken
worden samengevoegd en op de plaat gegoten. Het cDNA zal binden (hybridiseren) aan de genen in
de spots die een complementaire sequentie hebben. Na een incubatieperiode worden alle
ongebonden cDNA-moleculen weggespoeld waarna de plaat onder de fluorescentiemicroscoop
bekeken kan worden. Dan kan je aan de hand van de kleur zien welk gen het meest tot expressie is
gekomen.
Sequencing
We willen een onbekende mutatie in een gen opsporen. Eerst moeten we het gewenste gen in het
humane genoom opzoeken. Vervolgens amplificeer je het gen. Je ontwerpt hierbij primers om het
gen te amplificeren met PCR of je kloneert het gen in een bacterie. De laatste stap is het bepalen van
de basenpaarvolgorde van het gen, dat heet sequencing.
Sanger sequencing is een techniek die relatief lange reads van goede kwaliteit geeft. Maar er is een
slechtere kwaliteit tussen de 15-40 bp en na 700-900 basen.
CRISPR/Cas9
Gene editing met CRISPR-CAS9. CRISPR-CAS als virale verdediging in bacteriën.
De belangrijkste toepassingen van CRISPR-CAS9:
- Gen knock-out maken
- Site directed mutagenese (Site directed mutagenese is een methode om specifieke mutaties
te maken in een dubbel strengs plasmide DNA.)
o Punt mutaties
o Grotere mutaties
Andere toepassingen
- Het kan gen expressie reguleren -> activatie/repressie
- Epigenetische modificatie
- Genome labeling
- RNA silencing
Een voordeel van CRISPR-CAS9 is dat je verschillende mutaties in een keer kan aanbrengen.
Cas9: Endonuclease -> knipt het DNA
sgRNA: Guide RNA -> bevat een ‘target recognition motive’ en bevat een tracrRNA motief wat zorgt
voor Cas9 rekrutering.
PAM (GGN): Protospacer adjacent motive -> moet aanwezig zijn in target DNA, Cas9 knipt 2 tot 3
nucleotiden upstream van PAM.
Verschillende Cas9 varianten hebben verschillende PAM’s.
Als een virus een bacterie aanvalt, zal het zijn DNA in de bacterie inbrengen om daar te laten
reproduceren. Maar sommige bacteriën hebben een uitgelezen verdedigingsmechanisme: ze hebben
in hun DNA een databank opgebouwd van virus-DNA, zodat zodra een virus DNA inbrengt in de
bacterie, deze laatste dit DNA herkent en vernietigt. Ze doen dit door een stukje van het ‘opgeslagen’
virus-DNA te reproduceren. Dat stukje hecht zich aan Cas9; een eiwit dat in staat is dna te knippen.
3
, Op het moment dat het geïnjecteerde virus-DNA in de buurt komt en het past op het
gereproduceerde stukje, dan omarmt Cas9 het virus-DNA en knipt het in tweeën.
CRISPR-CAS9 maakt gericht een gen knock-out, het bevat dus
- Guide RNA
o Bevat een “target recognition motive”
o Bevat tracrRNA motief wat zorgt voor Cas9 rekrutering
- PAM: protospacer adjacent motief
o Moet aanwezig zijn in target DNA
- Cas9 is een endonuclease
o Cas9 knipt 2 tot 3 nucleotiden upstream van PAM
Transfectie met ribonucleoproteins (RNP’s)
- crRNA/Cas9 ribonucleoproteïnes kunnen direct in de cel worden geïnjecteerd
- Dit kan bijvoorbeeld door micro injectie in een insecten embryo
Transfectie kan ook plaats vinden met All-in-one vectoren
- Na transfectie brengt de vector het Cas9 en het gRNA tot expressie.
FISH en CHG
- Bij FISH binden probes aan specifieke target sequences van het DNA. Aan deze probes zitten
fluorescente moleculen vast. Onder een speciale microscoop waarbij je fluorescentie kan
zien kan je het wel of niet aanwezig zijn van een specifieke genetische afwijking zien.
- Bij FISH kan je concluderen waar de afwijking op een chromosoom zit.
- Bij CGH moet je eerst het DNA isoleren en vervolgens moet je het DNA labelen met
verschillende kleuren fluorescente moleculen. Vervolgens zal het gelabelde DNA binden aan
het originele locus. Met computer software kan je dan de verschillen in DNA bekijken.
- Bij CGH kan je concluderen op welk chromosoom de afwijking zit
- Bij FISH moet je weten op welk chromosoom de afwijking zit en bij CGH hoef je dit niet te
weten.
Griffiths H14: Genomes and genomics
Je kan de geschiedenis van het humane genoomproject samenvatten en je begrijpt
hoe nieuwe sequencing technieken dit project veranderden
Het humane genoom project of de ‘genoom oorlog’
De race om het eerste humane genoom: HGP vs. TIGR
Department of Energy (DoE) regelde geld en startte het Humane Genoom Project (HGP), dit zou rond
de 15 jaar duren en er was een budget van 1 miljard dollar voor de eerste zeven jaar.
Maar toen kwam er een (rivaliserend) tweede humane genoom project van het National Institute of
Health (NIH) met directeur James Watson.
Watson sequencde ook het genoom van muizen en fruitvliegjes.
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller xMelissa. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.73. You're not tied to anything after your purchase.
