Deze samenvatting bevat alle colleges van moleculaire technieken van heel course 5. In deze samenvatting is duidelijk onderscheid gemaakt tussen blok 1 en blok 2. Blok 1 kan worden getoetst tijdens de kennistoets en blok 2 bij de thematoets van course 5. Alle technieken die van toepassing zijn gew...
Gene expression and post-transcriptional modification
All for this textbook (12)
Written for
Hogeschool Arnhem en Nijmegen (HAN)
Biologie En Medisch Laboratoriumonderzoek
Moleculaire technieken (BM5BC_MOL_TECH)
All documents for this subject (4)
2
reviews
By: huyentran • 2 year ago
By: marlinde1 • 2 year ago
Seller
Follow
sammessing
Reviews received
Content preview
Kloneren: meerdere kopieën van een bepaald gen maken.
IDH1 gen in plasmide plaatsen door middel van restrictie. Om dat te kunnen doen moeten we het
IDH1 gen vermeerderen en restrictie sites aan plakken met behulp van PCR. Als je restrictie sites aan
je gen hebt gemaakt kun je die knippen, dan heb je je gen dat precies in de plasmide geplakt kan
worden en vervolgens in een bacterie zetten die het kan vermeerderen.
PCR
wat heb je nodig voor een PCR reactie?
- DNA template, zit het gen in
- DNA polymerase, enzym dat je nodig hebt om de
nucleotide in de nieuwe streng in te bouwen.
- Primers, want polymerase heeft iets nodig om op vast
te zitten. Startpunt voor DNA polymerase.
- Buffer, pH niveau stabiel houden. DNA polymerase is
een enzym en die heeft een bepaalde pH nodig om te
werken.
- MgCl2, is een zout dat DNA polymerase nodig heeft
om zijn werk te doen.
- dNTP, losse nucleotides die de DNA polymerase in
gaat bouwen in de streng.
DNA template
- plasmide DNA
- genomisch DNA uit de cel
- cDNA (mRNA uit de cel geïsoleerd en vervolgens via reverse trans omgezet naar cDNA) coderende
delen van het gen. Alle intronen zijn eruit.
Hoeveelheid DNA template moet niet te hoog maar ook niet te laag zijn. Te hoog verstoord PCR
reactie.
DNA polymerase
Taq DNA polymerase: uit warme bron bacterie, heft geen proofreading.
pfu DNA polymerase: proofreading activiteit. Maakt minder fouten
,Primer design.
Eerst de kanten van het DNA bepalen.
loaction
,Conditions for a good primer
* 50-60% CG. Meer waterstofbruggen vormen. Binden goed aan het DNA.
* 3’eind moet aan het uiteinde een C of G hebben, omdat de binding dan steviger is en dan kan de
polymerase dit als startpunt gebruiken.
* het kan zijn dat als er sequenties in je primer zitten die complementair zijn aan elkaar, kan de
primer zich dubbelvouwen. Dan kunnen die complementaire nucleotiden aan elkaar binden en dan is
hij niet bruikbaar want dan zit de primer dubbel gevouwen in plaats van dat hij op het DNA kan gaan
binden. Dat dubbelvouwen noemen we een hairpin formation.
* wat we ook niet willen is dat sequenties in zitten die aan elkaar gaan zitten primer dimer
formation.
* afstand tussen de primers is 1 tot 2 kb, maar niet groter. Hangt wel af van het gen. (voor normale
PCR)
* Annealing temperatuur 55-65 graden Celsius. De temperatuur waarbij de primer goed en specifiek
op je DNA gaat vast zitten. Primers mogen niet te veel verschillen in de annealing temperatuur, niet
meer dan 5 graden celcius.
ATG is startcodon.
TGA is stopcodon.
Primers zijn tussen de 19-24 nucleotide
The PCR program
wat gebeurd er tijdens de stappen en waarom hebben we die nodig?
Denaturatie, annealing en elongatie
denatureren
annealing
elongatie
, Denatureren: DNA template uit elkaar smelten, zodat de primers kunnen binden.
Annealing: startpunt geven voor DNA polymerase om het DNA te verlengen.
Elongatie: verlengen van het DNA.
- deze stappen herhaal je een aantal keer.
Op welke temperatuur en waarom?
rond de 95 graden, maar het hangt af van de DNA polymerase die je gebruikt.
Primers annealing temperatuur: tussen de 55 en 65 graden afhankelijk van de primerset.
Elongatie temperatuur: 72 graden.
opslag tussen de 4 en 14 graden.
te hoge temperatuur?
DNA polymerase is een eiwit, dus deze kan niet tegen te hoge temperaturen en denatureert hij
zichzelf. Optimale temperaturen.
Annealing temperatuur: te laag? de primers binden niet op de juiste plek aan het DNA template.
De moleculen bewegen namelijk niet zo hard.
temperatuur te hoog? De moleculen bewegen te hard waardoor de primers los laten.
elongatie/extension: hoge temperatuur zodat de polymerase er af gaat.
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens PCR te laag is gezet voor de primers?
Dan krijg je a-specifieke binding en als je pech hebt een a-specifiek product
En een te hoge annealing temperatuur?
De moleculen bewegen teveel dat de primers losraken. Ze kunnen niet binden. je krijgt geen PCR
product
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens de PCR alleen maar goed is voor één primer?
De andere primer komt op de verkeerde plek te zitten, a-specifieke binding.
Plasmide in DNA
cloning vector
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sammessing. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.69. You're not tied to anything after your purchase.
