Hoofdstuk 1: Introductie in celkweek
Leerdoelen:
- Het verschil uitleggen tussen primaire en continue cellijnen
- Aangeven welke besmettingen in een celkweek aanwezig kunnen zijn en op welke
manier deze bestreden kunnen worden
- Uitleggen welk effect de condities in een kweekstoof hebben op cellen in het medium
Het verschil uitleggen tussen primaire en continue cellijnen:
- Primair: rechtstreeks afkomstig van het orgaan van een mens of dier of van een
embryo. Bestaat uit meerdere celtypen. Cellijnen kunnen beperkt aantal keer
gepasseerd worden cellijn verliest vitaliteit en sterft af of cellijn gaat over in
een continue cellijn.
- Continue: cellen hebben eigenschappen van getransformeerde cellen of
kankercellen. Bestaat uit 1 celtype. Cellijn kan lang in leven worden gehouden,
zonder dat de eigenschappen dusdanig veranderen dat ze onbruikbaar worden.
Aangeven welke besmettingen in een celkweek aanwezig kunnen zijn en op welke manier
deze bestreden kunnen worden:
1. Plotselinge daling of stijging in de pH-waarde van het medium en verandering kleur
(bacterie). Soms een stijging bij infectie met bepaalde schimmels.
2. Wolken in het medium (schimmels)
3. Loslaten bodem of afronden (bacteriën of gisten). Onder de microscoop is dit
zichtbaar als ‘gaten’ in de monolayer.
4. Bij hoge vergroting zijn individuele bacteriën te zien
Na ontdekking besmetting als volgt handelen:
1. Identificeer de aard van het organisme (virus, bacterie, schimmel, etc.)
2. Zoek het juiste antibioticum of een alternatief als er al antibioticum is gebruikt
3. Was de kweek een aantal keren door te spoelen of door te centrifugeren
4. Laat de kweek 3 passages groeien in aanwezigheid van antibiotica en daarna 3 in
afwezigheid van antibiotica
Uitleggen welk effect de condities in een kweekstoof hebben op cellen in het medium:
1. Temperatuur: een temperatuur van 37 graden is ideaal voor humane cellen: bij 37
graden is de enzymactiviteit van humane cellen optimaal; 39,5 graden is maximaal
anders sterven cellen binnen een paar uur af.
2. Zuurgraad (pH): optimale pH is 7,4. Er wordt een pH-indicator toegevoegd om de pH
van een kweek in de gaten te houden (rood pH 7,4; oranje pH 7,0; geel pH 6,5;
limoengeel pH <6,4)
3. Koolstofdioxide en natriumbicarbonaat:
, Een hoge concentratie H+ betekent een
lage pH. Dit betekent dat een verhoogde CO2 druk deze reactie meer naar rechts zou doen
verlopen. Met gevolg dat het medium verzuurt en dus geel wordt. Hier kunnen cellen in het
algemeen slecht tegen. Wanneer de bicarbonaat (HCO3) concentratie echter verhoogd
wordt, dan wordt de reactie meer naar links gestuurd.
4. Zuurstof: te veel zuurstof leidt tot verhoogd aantal radicalen die cel schade
opleveren.
Extra informatie:
- Monolaag / monolayer: na overbrengen zullen cellen bezinken op de bodem van de
kweekfles, zich hieraan vasthechten en ong. 1x per dag delen totdat de hele bodem
bedekt is.
- Trypsine: verbreekt intracellulaire verbindingen waardoor individuele cellen of kleine
groepjes van cellen worden gevormd.
- Passeren / doorzetten: een primaire celkweek groeit door en een gedeelte van de
gekweekte cellen wordt geoogst om daarmee weer een nieuwe kweek te starten.
- Antibacteriële agentia (stoffen): penicilline en streptomycine
- Antimycoplasma agentia: mycoplasma zijn de kleinste prokaryote organismen die
nog in staat zijn zich zelfstandig voort te planten. Ze hebben geen echte stevige
celwand, zijn voor hun metabolisme onafhankelijk van zuurstof en zijn onzichtbaar
voor het blote oog.
Er zijn antibiotica die eiwitsynthese verstoren, de DNA synthese remmen, de bouw van
de celmembraan verstoren, de permeabiliteit van de celmembraan verstoren / de
werking van een bepaald enzym verstoren.
- Penicilline remt synthese van peptidoglycanen in de membraan van bacteriën
- Streptomycine remt eiwitsynthese in mycoplasma / mycobacterium
Nadelen van gebruik van antibiotica in celkweek:
1. Mogelijke kleine besmettingen met bacteriën die worden geremd, maar niet gedood
door de antibiotica, worden gemaskeerd (verborgen).
2. Mycoplasma infecties kunnen ook gemaskeerd worden door antibiotica.
3. Er zijn antibiotica die een negatief effect hebben op het metabolisme van de cel.
Daardoor zou de cel zich onder bepaalde omstandigheden bij antibioticumgebruik
anders kunnen gedragen dan wenselijk is.
4. Ze bevorderen onzorgvuldig werken als het aankomt op de steriliteit.
, LAF-kasten:
- Horizontaal: de lucht stroomt uit de kast recht in het gezicht van de werker kast
beschermt het materiaal in de kast tegen infectie van buitenaf, maar biedt geenszins
bescherming voor de werking zelf. HEPA filter: van der Waals krachten aan het opp.
van de vezels zorgen voor het tegenhouden van 99,97% van alle deeltjes groter dan
0,3 micrometer.
- Verticaal:
o Klasse I: de lucht uit de omgeving wordt naar binnen gezogen via een kleine
opening aan de voorkant. De rest van de voorkant is afgeschermd met een
ruit. Via een HEPA filter wordt de lucht die in de kast wordt gezogen
gefilterd en weer in de kamer of in een ventilatiesysteem geblazen. De
kasten beschermen de werker dus goed, maar beschermen het materiaal
niet (de lucht die naar binnen wordt gezogen is immers lucht uit de kamer
en dus niet steriel).
o Klasse II: de lucht wordt via een aparte HEPA filter van bovenaf aangezogen
en zo als een laminaire luchtstroom in de kast geblazen van boven naar
beneden (downstream). Onderaan aan de voorkant en aan de achterkant
van het werkoppervlak wordt de lucht afgezogen waardoor een luchtgordijn
ontstaat om de ruimte van de kast af te sluiten van de buitenlucht. De
afgezogen lucht wordt in sommige typen direct door een andere HEPA filter
afgevoerd naar buiten. De lucht die de kast verlaat is stofvrij.
o Klasse III: lijken qua ontwerp en luchtcirculatie op de type II kasten, maar in
deze kasten is de werkopening vervangen door permanent bevestigde
handschoenen waar de werker zijn onderarmen insteekt. Via een luchtsluis
die vaak aan de zijkant zitten kunnen materialen in en uit de kast worden
gebracht.
Leerdoelen:
- Het verschil uitleggen tussen primaire en continue cellijnen
- Aangeven welke besmettingen in een celkweek aanwezig kunnen zijn en op welke
manier deze bestreden kunnen worden
- Uitleggen welk effect de condities in een kweekstoof hebben op cellen in het medium
Het verschil uitleggen tussen primaire en continue cellijnen:
- Primair: rechtstreeks afkomstig van het orgaan van een mens of dier of van een
embryo. Bestaat uit meerdere celtypen. Cellijnen kunnen beperkt aantal keer
gepasseerd worden cellijn verliest vitaliteit en sterft af of cellijn gaat over in
een continue cellijn.
- Continue: cellen hebben eigenschappen van getransformeerde cellen of
kankercellen. Bestaat uit 1 celtype. Cellijn kan lang in leven worden gehouden,
zonder dat de eigenschappen dusdanig veranderen dat ze onbruikbaar worden.
Aangeven welke besmettingen in een celkweek aanwezig kunnen zijn en op welke manier
deze bestreden kunnen worden:
1. Plotselinge daling of stijging in de pH-waarde van het medium en verandering kleur
(bacterie). Soms een stijging bij infectie met bepaalde schimmels.
2. Wolken in het medium (schimmels)
3. Loslaten bodem of afronden (bacteriën of gisten). Onder de microscoop is dit
zichtbaar als ‘gaten’ in de monolayer.
4. Bij hoge vergroting zijn individuele bacteriën te zien
Na ontdekking besmetting als volgt handelen:
1. Identificeer de aard van het organisme (virus, bacterie, schimmel, etc.)
2. Zoek het juiste antibioticum of een alternatief als er al antibioticum is gebruikt
3. Was de kweek een aantal keren door te spoelen of door te centrifugeren
4. Laat de kweek 3 passages groeien in aanwezigheid van antibiotica en daarna 3 in
afwezigheid van antibiotica
Uitleggen welk effect de condities in een kweekstoof hebben op cellen in het medium:
1. Temperatuur: een temperatuur van 37 graden is ideaal voor humane cellen: bij 37
graden is de enzymactiviteit van humane cellen optimaal; 39,5 graden is maximaal
anders sterven cellen binnen een paar uur af.
2. Zuurgraad (pH): optimale pH is 7,4. Er wordt een pH-indicator toegevoegd om de pH
van een kweek in de gaten te houden (rood pH 7,4; oranje pH 7,0; geel pH 6,5;
limoengeel pH <6,4)
3. Koolstofdioxide en natriumbicarbonaat:
, Een hoge concentratie H+ betekent een
lage pH. Dit betekent dat een verhoogde CO2 druk deze reactie meer naar rechts zou doen
verlopen. Met gevolg dat het medium verzuurt en dus geel wordt. Hier kunnen cellen in het
algemeen slecht tegen. Wanneer de bicarbonaat (HCO3) concentratie echter verhoogd
wordt, dan wordt de reactie meer naar links gestuurd.
4. Zuurstof: te veel zuurstof leidt tot verhoogd aantal radicalen die cel schade
opleveren.
Extra informatie:
- Monolaag / monolayer: na overbrengen zullen cellen bezinken op de bodem van de
kweekfles, zich hieraan vasthechten en ong. 1x per dag delen totdat de hele bodem
bedekt is.
- Trypsine: verbreekt intracellulaire verbindingen waardoor individuele cellen of kleine
groepjes van cellen worden gevormd.
- Passeren / doorzetten: een primaire celkweek groeit door en een gedeelte van de
gekweekte cellen wordt geoogst om daarmee weer een nieuwe kweek te starten.
- Antibacteriële agentia (stoffen): penicilline en streptomycine
- Antimycoplasma agentia: mycoplasma zijn de kleinste prokaryote organismen die
nog in staat zijn zich zelfstandig voort te planten. Ze hebben geen echte stevige
celwand, zijn voor hun metabolisme onafhankelijk van zuurstof en zijn onzichtbaar
voor het blote oog.
Er zijn antibiotica die eiwitsynthese verstoren, de DNA synthese remmen, de bouw van
de celmembraan verstoren, de permeabiliteit van de celmembraan verstoren / de
werking van een bepaald enzym verstoren.
- Penicilline remt synthese van peptidoglycanen in de membraan van bacteriën
- Streptomycine remt eiwitsynthese in mycoplasma / mycobacterium
Nadelen van gebruik van antibiotica in celkweek:
1. Mogelijke kleine besmettingen met bacteriën die worden geremd, maar niet gedood
door de antibiotica, worden gemaskeerd (verborgen).
2. Mycoplasma infecties kunnen ook gemaskeerd worden door antibiotica.
3. Er zijn antibiotica die een negatief effect hebben op het metabolisme van de cel.
Daardoor zou de cel zich onder bepaalde omstandigheden bij antibioticumgebruik
anders kunnen gedragen dan wenselijk is.
4. Ze bevorderen onzorgvuldig werken als het aankomt op de steriliteit.
, LAF-kasten:
- Horizontaal: de lucht stroomt uit de kast recht in het gezicht van de werker kast
beschermt het materiaal in de kast tegen infectie van buitenaf, maar biedt geenszins
bescherming voor de werking zelf. HEPA filter: van der Waals krachten aan het opp.
van de vezels zorgen voor het tegenhouden van 99,97% van alle deeltjes groter dan
0,3 micrometer.
- Verticaal:
o Klasse I: de lucht uit de omgeving wordt naar binnen gezogen via een kleine
opening aan de voorkant. De rest van de voorkant is afgeschermd met een
ruit. Via een HEPA filter wordt de lucht die in de kast wordt gezogen
gefilterd en weer in de kamer of in een ventilatiesysteem geblazen. De
kasten beschermen de werker dus goed, maar beschermen het materiaal
niet (de lucht die naar binnen wordt gezogen is immers lucht uit de kamer
en dus niet steriel).
o Klasse II: de lucht wordt via een aparte HEPA filter van bovenaf aangezogen
en zo als een laminaire luchtstroom in de kast geblazen van boven naar
beneden (downstream). Onderaan aan de voorkant en aan de achterkant
van het werkoppervlak wordt de lucht afgezogen waardoor een luchtgordijn
ontstaat om de ruimte van de kast af te sluiten van de buitenlucht. De
afgezogen lucht wordt in sommige typen direct door een andere HEPA filter
afgevoerd naar buiten. De lucht die de kast verlaat is stofvrij.
o Klasse III: lijken qua ontwerp en luchtcirculatie op de type II kasten, maar in
deze kasten is de werkopening vervangen door permanent bevestigde
handschoenen waar de werker zijn onderarmen insteekt. Via een luchtsluis
die vaak aan de zijkant zitten kunnen materialen in en uit de kast worden
gebracht.
