Summary
Samenvatting Molmic
- Course
- Institution
Deze samenvatting is bedoeld voor studenten die de specialisatie microbiologie volgen.
[Show more]
Seller
Follow
manarlzz
Content preview
Samenvatting moleculaire microbiologieLes 1 en 2
Klassieke technieken:
- Morfologie
- Bacterie kleuringen
- Groei op kweekmedia onder verschillende laboratorium condities
- Fenotypering op basis van biologische kenmerken (identificatie: bonte rij, Api)
- Nadeel van klassieke technieken is dat het veel tijd kost. Bacteriën moeten groeien
etc.
Moderne technieken:
- Rt PCR: amplificatie (qPCR is kwanitifactie)
- Sequencing
- Maldi-TOF
- Microscopie
- Andere testen zoals: hybridisatie (array), serologische testen (ELISA, agglutinatie
testen etc.)
Moleculaire technieken – mijlpalen:
- James Watson en Francis Crick (1953): Ontrafeling dubbele helix structuur (Nobelprijs
1962)
- Fred Sanger (1975): Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek (Nobelprijs 1980)
- Kary Mullis (1983): Uitvinding Polymerase Chain Reaction (Nobelprijs 1994)
- Roche 1992: Eerste commerciële moleculaire tests
Je begint bij het samplen van virus/bacterie, zodat je DNA krijgt. Bij bacterieonderzoek wordt
gebruik gemaakt van 16s RNA. Het is een onderdeel van ribosoom. Je kan het goed
gebruiken voor identificatie van soorten.
PCR en Q-PCR:
o Gebruikt als identificatiemethode op een moleculair lab
- Soort-specifieke amplificatie van 16s rRNA gen
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (‘’huishoudgenen’’)
- Amplificatie van resistentie-genen
- Amplificatie van het hele genoom
,DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep
- Suikergroep (deoxyribose)
- Stikstofbase (A,G,C, T)
- Purines: Adenine en Guanine
- Pyrimidines: Thymine en Cytosine
- 3 nucleotiden: een triplet of codon (coderen voor een specifiek aminozuur)
- Aminozuren zijn de bouwstenen van eiwitten
Chemische structuur DNA:
- Lange, dubbele helix met suiker (deoxyribose) en fosfaat buitenstructuur. Basen aan
de binnenzijde.
- Gestabiliseerd door waterstofbruggen tussen de basen.
- Strengen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement).
DNA:
- Een purine (A en G) bindt altijd met een pyrimidine (C en T) base (behoudt de
structuur).
- Adenine bindt aan thymine met twee waterstofbruggen.
- Guanine bindt aan cytosine met drie waterstofbruggen.
2
,Verschil DNA en RNA:
- DNA heeft deoxyribose, RNA heeft ribose
- DNA heeft 2 strengen, RNA heeft 1 streng
- DNA heeft thymine, RNA heeft uracil
Reverse transcriptase:
- Er ontstaat een DNA-RNA hybride
- Reverse transcriptase: an enzyme binds to oligo (nucleotidensequentie met een
beperkt aantal nucleotiden) dT primer and synthesis the cDNA (DNA dat door
reverse-transcriptase uit mRNA is verkregen; bevat geen introns of
signaalsequenties) by adding dNTPs.
- RNA hybrid formation: first – strand cDNA synthesis
Essentiële ingrediënten PCR-mix:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTPs
o 20-200 micrometer van alle 4 de dNTPs
o Een te hoge concentratie kan synthesefouten veroorzaken
- PCR-buffer
o Tris-HCL buffer van pH=7,8 is optimaal
o Optioneel zijn Tween (stabilisteert Taq), BSA en eenwaardige ionen
- Taq-DNA polymerase (Thermus aquaticus)
o Essentieël: hittestabiel
o Snelle synthese
o Gevoelig voor allerlei remmende stoffen
o Géén 3’-5’ exonuclease activiteit, dus géén proofreading
- MgCl2, essentiële co-factor voor Taq en heeft stabiliserend effect
3
, - Primers
o Ongeveer tussen de 18-25 nucleotiden lang
o Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40% tot 70%)
o Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
o Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen twee primrs (primer-
dimeer)
o Amplicon (piece of DNA or RNA that is the source and/or product of
amplification or replication events) bij voorkeur 75-200 basenparen.
Hoogste efficiëntie
o Smelttemperatuur (Tm ) tussen circa 50 en 65 graden celcius
- Polymerase remmers
o Proteolytische enzymen (pronase, proteïnase K)
o Heparine, ijzerionen profyrine-skeletten (bloed)
o DMSO (hoge concentratie)
o Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
o SDS
o Ureum
Keuze gen:
Conservatief houdt in dat de sequenties erg op elkaar lijken.
Goede primers:
- voordeel rtPCR: geen
gel nodig.
- Voor PCR detectie
van specifieke
sequenties (lab
vereisten):
1. Specifieke
technische
handelingen,
reagentia en
personeel.
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller manarlzz. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.91. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
84866 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now