Summary
Samenvatting Moleculaire Genetica Diagnostiek
- Course
- Institution
Samenvatting + notities van tijdens de les
[Show more]
Seller
Follow
amberdams
Reviews received
Content preview
1 Analysemethoden voor nucleïnezuren1.1 Inleiding
- Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003 (> 10 jaar om genoom te sequensen)
- Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
▪ Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zicht-
baar maken
▪ Voor veel ziekten: verantwoordelijke gen en welke fout in gen
- Nieuwe behandelingen:
▪ Productie recombinante eiwitten (= eiwit dat men aangemaakt heeft door de code van het EW
in te brengen in m.o. of zoogdiercellen) voor therapie
▪ Gen- en stamceltherapie
- Diagnosetechnieken:
▪ Cytogenetische onderzoeksmethoden → uitzicht chomosomen
▪ Moleculaire onderzoeksmethoden → structuur aparte DNA-moleculen
1.1.1 Cytogenetische onderzoeksmethoden
1.1.1.1 Karyotypering
- Vertrek uit perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook soms uit beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion (één van
de membranen tussen foetus en moeder) villi
- Toevoegen fytohemagglutinine → stimulatie T-lymfocyten → mitose
- Na 48 – 72 uur: toevoeging colchicine (interfereert met de vorming van spoeldraden)→ stopt
celdeling in de metafase (chromos. net zichtbaar)
- Toevoegen hypotone oplossing → water opnemen → opzwellen → individuele chromos. scheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
1.1.1.2 G-banding
Gebruik van Giemsa-kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere bandjes, karakteristiek
voor ieder chromosomenpaar:
- Donkere bandjes: weinig genen, zijn
AT-rijk en repliceren laat in S-fase
- Lichte bandjes: 80% actieve genen
(huishoud-genen), GC-rijk en repliceren
vroeg in S-fase
- Precieze identificatie elk chromosoom
en ontbreken of bijkomen DNA-
materiaal tot 4000 kb
- Betere resolutie = FISH (fluorescence in situ hybridization), FCM of analyse DNA met aCGH (array
comparative genomic hybridision)
Alternatief: Quinacrine-kleuring → Q-banding
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 1
,1.1.1.3 Flow karyotypering
- Modernere techniek met betere resolutie
- Gebruikt om variatie in chromos. na te gaan en identificatie chromosoomafwijkingen
- Resolutie = 1 – 2 Mb t.o.v. 4 Mb voor lichtmicroscopische karyotypering
Resultaat:
- Flow karyotypes man en vrouw, elke piek =
individueel chromosomenpaar van groepen
chromosomen
- DNA-inhoud individuele chromosomen meten
m.b.v. FCM → vloeistofstroom door laser
- Chromosoomsuspensie kleuren: ethidium
bromide = fluorescerende kleurstof
- Meting: fotomultiplier
- Analyse: m.b.v. computer
- Resultaat:
▪ Histogram/ flow karyotype → chromos.
groeperen volgens stijgende DNA-inhoud
▪ Relatieve DNA-inhoud = gem. piek
▪ Relatief # chromos. in elke groep =
oppervlak onder piek (normaal 2)
▪ X-chromos. bij vrouw 2x groter dan bij man
1.1.2 Moleculaire onderzoeksmethoden
= bestuderen nucleïnezuren
Hoe?
- DNA- en RNA-isolatie
- DNA-detectie:
▪ Elektroforese
▪ Hybridisatie
• DNA probes
• Detectie van labels
• Stappen in het hybridisatieproces
• Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation (aCGH)
- PCR en afgeleide technieken
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool → 3FBT
1.2 DNA- en RNA-isolatie
- mRNA’s isoleren: poly(A)-staart aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)oligonucleotide te koppelen op magnetische beads
- Rnase vrij werken (bakken glasmateriaal, handschoenen dragen) en gebruik Rnase-remmers
- DNA: denaturatie en extractie
- Detectie:
▪ UV-absorptie DNA en RNA bij 260 nm
▪ UV-absorptie eiwitten bij 280 nm
▪ OD-ratio? 260 nm/ 280 nm → zuiverheid staal (DNA isoleren uit bloedstaal met EW)
▪ Intercalerende kleurstoffen (nestelen zich tussen baseparen): fluorescerende DNA en RNA
kleurstoffen → EtBr of SYBR Green
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 2
,1.2.1 DNA isolatie
- Via denaturatie en extractie
- Gebruik van zouten om eiwitten te denatureren en hoogmoleculaire NZ in oplossing
te houden
- Isoleren: absorptie op silicadeeltjes (kolommen) of filtratie over semi-permeabele
membraan waaraan DNA blijft plakken = DNA-vlok
1.2.2 mRNA isolatie
→ magnetische bolletjes met een T-staart
→ mRNA kan binden door hun A-staart
1.3 DNA-detectie
1.3.1 Gel-elektroforese
- Gebruik van agarose matrices (of polyacrylamide)
- DNA- en RNA moleculen d.m.v. hoog oplossend
vermogen scheiden
- Door negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïne-
zuren bewegen zich bij pH 7 à 8 naar + pool
- Migratiesnelheid is afhankelijk van: type gelmatrix,
poriëngrootte, moleculaire afmetingen NZ en
conformatie NZ
Procedure:
Houder afplakken → “kammetje” plaatsen met slotjes → DNA staal laden → agarose in buffer brengen
→ opwarmen in microgolfoven → afkoelen tot 55°C → uitgieten → agarose gaat stollen = geleren →
einde elektroforese → op UV-transeleminator bekijken (tegenwoordig in geïntegreerd systeem)
1.3.1.1 Intercalerende stoffen
Ethidiumbromide
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen → vermijden → nu gebruik SYBR Safe!
- Werking: kruipt tussen baseparen → gebruik UV licht → DNA moleculen zichtbaar
SYBR Green = SYBR Safe
- Excitatie: max = 497 nm
- Emissie: max = 520 nm → licht uitzenden
- Minder mutageen dan EtBr, maar cytotoxisch → penetreert cellen
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 3
, 1.3.1.2 DNA gelelektoforese
Negatieve pool
Groot
Klein
Positieve pool
Legende:
- Links = lengtemerken van DNA-fragmenten met gekende grootte
- Midden = DNA geknipt mey drie verschillende restrictie enzymen
- Rechts = controle DNA, niet geknipt
1.3.1.3 RNA gelelektroforese
Negatieve pool
Positieve pool
Moeilijker, uit één celtype al het mRNA of totaal RNA isoleren → alle fragmenten verschillende lengte
→ nooit genoeg RNA-moleculen van zelfde lengte om zichtbaar te zijn op gel (bepaalde detectielimiet)
Wat is wel te zien:
- 28S rRNA (intenisteit 2x zo groot als de intensiteit van 18S rRNA)
- 18S rRNA
Legende:
- Laan 1 en 2: intacte RNA-stalen met 28S:18S rRNA ratio = 2:1
- Laan 3: gedegradeerd RNA met RNA smeer onder 28S en 18S rRNA bandjes
- Laan 4: gedegradeerd RNA → verlies 28S rRNA band en opstapeling gedegradeerd RNA onderaan
- Laan 5: RNA met aanzienlijke genomische DNA contaminatie
1.3.1.4 Polyacrylamide gelelektroforese
- Voor scheiden van DNA
- resolutie of oplossend vermogen → mogelijkheid om zeer kleine verschillen in lengte van elkaar
te onderscheiden (1 tot enkele nucleotiden)
- Handig voor zeer korte fragmenten
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller amberdams. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $15.46. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
56326 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now