Summary
Samenvatting Moleculaire Diagnostiek 2
- Course
- Institution
- Book
Een samenvatting van de lessen moleculaire diagnostiek 2 van het tweede studiejaar MD.
[Show more]
Connected book
Book Title:
Author(s):
- Edition:
- ISBN:
- Edition:
More summaries for
-
Test Bank for Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods, and Clinical Applications, 3rd Edition, Lela Buckingham.
-
Test Bank for Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods, & Clinical Applications, 1st Edition, Maribeth L. Flaws, Lela Buckingham.
-
Leerdoelen Moleculaire diagnostiek
Seller
Follow
01sanne
Reviews received
Content preview
Moleculaire diagnostiek 2 – les 1, Human Identification (H10)Veranderingen in genoom
- Puntmutaties (single nucleotide polymorfismes (SNP)) → silent/ missense/ nonsense
- Smale-scale mutaties → inserties/ deleties
- Large-scale mutaties → amplificaties/ chromosomale translocaties
Karyotypering: tumordiagnostiek
- Kleuren van chromosomen
- Spectral karyotypering (SKY)
- Kleurstof gebonden aan specifieke stukken DNA
- Hybridisatie
Hybridisatie (FISH, probe met label)
1. Dubbelstrengs DNA van patiënt → met target sequentie die moet worden
aangetoond
2. Denaturatie
3. Hybridisatie met gelabelde probe → tijdens renaturatie van DNA hecht de probe aan
de complementaire sequentie in het DNA
PCR
- Denaturatie → 94 °C
- Annealing → hybridisatie van primers/ Ta = Tm-5/ stringentie wordt met name door
de temperatuur bepaald
- Elongatie → 72 °C
(Reverse transcriptase: zet mRNA om in cDNA wat kan worden gebruikt voor PCR)
Analyse van PCR
1. Aantonen van PCR product → kleuring met ethidiumbromide (kwalitatief of
kwantitatief)
2. Identificeren van een PCR product → hybridisatie met een gelabelde probe
Speciale PCRs
Multiplex PCR
- Meerder primersets in 1 reactie
- Binnen 1 monster meerdere bepalingen
- Q: wie is met grote waarschijnlijkheid het slachtoffer van de verdachte
Detectietechnieken
Direct
- Absorptie bij 260 nm
- Fluorescerende kleurstoffen: bv. Ethidiumbromide en midori green
Indirect
- Hybridisatie (met probes)
- Immunologisch (met antlichamen)
Detectie van hybridisatie:
Direct:
, - Elektronenmicroscoop
Indirect via gelabelde probes
- Radio-isotopen → autoradiografie
- Fluorochromen → fluorescentiemeting
- Haptenen → specifieke antilichamen
- Enzymen → substraatomzetting (spectrofotometrie, luminescentie, gekleurd
neerslag)
Scheidingstechnieken
Elektroforese
- Southern blot (DNA)
- Northern blot (RNA)
DNA sequencing
- Sanger sequencing
DNA polymorfismes
- Grote verschillen in DNA tussen mensen → omdat 98% niet codeert voor genen
- Ong. elke 1000 tot 1500 bp is ons genoom verschillend → SNP (Single Nucleotide
Polymorfismes)
- Naast SNP ook verschillende repeterende stukken DNA waarvan iedereen een ander
aantal repetities heeft
Human Identification
Waarom?
- Forensische vraagstukken (wie is de dader)
- Klinische vraagstukken (is het monster wel van die patiënt/ donoren/ transplantaties)
- Persoonlijke vraagstukken (wie is de vader)
Vroeger: eiwitten
Tot 1988: Polymorfe eiwitten
- ABO en rhesus
- HLA (human leukocyte antigen)
- Polymorfe eiwit systemen
Uiteindelijk slechts 10 polymorfe eiwitmarkers
Nadelen:
- Onderscheidend vermogen 1 op 1000
- Biologische ‘’sporen’’ onbruikbaar
- Sperma: slechts 2 polymorfe eiwitmarkers (ABO en PGM)
Tegenwoordig → DNA
Genetische verschillen tussen mensen
- VNTRs (Variable number of Tandem Repeats)
- STRs (short tandem repeats)
- RFLPs (restriction fragment length polymorfismes)
- SNPs (single nucleotide polymorifismes)
Locus = een gen of regio in het DNA
,Allel = versie van een locus (mensen zijn diploïd, dus elke locus heeft 2 allelen)
RFLP (oud)
- (Oude) techniek om verschillen in DNA aan te tonen
- SNP’s zijn verantwoordelijk voor het introduceren of verwijderen van een restriction
site
- Door meerdere restriction sites te ‘’mappen’’ kan een DNA profiel gemaakt worden
- Gebaseerd op Southern blot
Repititief DNA
Niet coderend DNA bevat veel (40%) repetitief DNA
Minisatelliet DNA: (repeats 10-60 bp)
- VNTR’s (Variable number of tandem repeats)
- Detecteren met rescrictie enzymen en Southern blot (oud)
Microsatelliet DNA: (repeats 2-10 bp)
- STR’s (short tandem repeats)
- Op verschillende plekken in het genoom
- Gevoelig voor mutaties in aantal repeats
- Zeer geschikt voor identity assesment
- Detecteren met PCR
Voorbeeld: vaderschapstest met RFLP profiel
Father Mother
Locus Locus
1 2 1 2
Parents
Locus
1 2
Child
STR
Een betere en gevoelige methode is gebruik te maken van PCR (VNTR’s zijn daar te lang
voor)
- STR zijn kort (1-7 bp) en geschikt voor PCR (100-400 bp)
- STR’s zijn geflankeerd door unieke geconserveerde DNA sequenties, deze kunnen
gebruikt worden om unieke primers te ontwerpen
Voordelen:
- Minder DNA nodig doordat je PCR kunt toepassen
- Minimaal 10 ng ipv 100 ng DNA
- Kleinere stukken (dus gegarandeerd DNA) is geen probleem
- Veel sneller: 24-48 uur ipv 5-7 dagen
- Multiplex
, STR:
Allel ladders voor standaardisatie:
STR door capillair elektroforese:
Welke STR?
Er zijn primers voor tientallen STR’s commercieel verkrijgbaar
De naam zegt iets over de locus, of de plek op een chromosoom
- CD4: locus tussen CD4 en tirosephosphate isomerase
- D13S317: chromosoom 13, segment 317
Een extra locus (geen STR) wordt altijd meegenomen:
- Amelogenine locus: dit gen codeert voor tandmaturatie en is geloceerd op het X en Y
chromosoom. Het Y allel is 6 bp langer dan X allel. Dit resulteert in 2 pieken voor een
man en 1 voor een vrouw
CODIS: Combined DNA Indexing System
- 13 STR loci voor bepalen van DNA profiel
- In totaal zijn 22 loci (CODIS en Europese systemen) gecertificeerd
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller 01sanne. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.90. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
52510 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now