OMEE
Ingénierie du génome
B.Horard
I. Introduction
Il s’agit d’ajouter, d’enlever ou d’altérer une séquence d’ADN dans un organisme.
1. Pourquoi modifier le génome ?
Cela nous permet de comprendre le fonctionnement des gènes : caractérisation in vivo du fonctionnement des
gènes. Cela permet également de traiter/prévenir une pathologie associée à une mutation dans le génome (étude du
développement pathologique, pallier un défaut génétique, corriger une erreur) ou d’apporter un trait d’intérêt
économique (intérêt physiologique = résistance à un pathogène, croissance… et intérêt économique = trait physique
à la valeur ajoutée, production de protéines recombinantes…)
2. Comment faire cette modification du génome ?
Il faut identifier et isoler la séquence d’intérêt, ce qui correspond à la phase de clonage : on isole donc, puis on clone
et on insère dans un vecteur de transgénèse que l’on fait se multiplier et que l’on purifie et séquence ensuite. Puis, il
faut transférer le vecteur de transgénèse dans un organisme receveur, ce qui correspond à la transgénèse. Cette
transgénèse peut se faire par micro-injection dans un embryon précoce, dans le pronucléus mâle (les deux donnant
un individu transgénique) ou par transfection de cellules souches embryonnaires (micro injectées dans un
blastocyste puis réimplantation dans l’oviducte : on obtient une femelle pseudo-gravide qui donnera naissance à une
chimère).
II. Clonage de l’ADN
1. Identifier et isoler la séquence d’intérêt
Le matériel de départ correspond à un génome partiellement séquencé (ADN génomique ou cDNA). Il peut être isolé
par PCR, ce qui nous permet d’obtenir 2n copies du fragment d’intérêt, ou par synthèse de novo complète (in vitro) :
on part d’une séquence connue, on va réaliser des petits fragments de séquence qu’on va assembler par
chevauchement pour reformer le la séquence complète.
2. Clonage
A. Le clonage traditionnel avec enzymes de restriction
Il y a premièrement digestion de l’ADN par des enzymes de restriction au niveau des sites cibles de ces
endonucléases. Les enzymes génèrent des extrémités franches ou cohésives dues au palindrome lui-même. Il y a
ensuite formation d’un vecteur assemblé par ligature du fragment et d’un vecteur par l’ADN ligase après séparation
, sur gel d’agarose et purification des fragments sur colonne de silice. Le vecteur utilisé pour créer le vecteur assemblé
provient d’un plasmide possédant des sites multiples de clonage (MCS), une origine bactérienne et des gènes de
sélection bactérienne. Ce plasmide est ouvert, et afin d’éviter qu’il ne se referme sur lui-même, il faut modifier ses
extrémités par déphosphorylation à l’aide d’une phosphatase. A l’issue de ces manipulations, il est donc utilisable
comme vecteur pour recevoir le fragment à cloner.
Si on n’a pas de sites d’enzymes de restriction qui nous intéresse pour l’étape de clonage dans le vecteur, il faut
ajouter au préalable des sites de restriction par amplification PCR aux extrémités du fragment d’intérêt (du côté 5’
des amorces). NB : les bases ajoutées ne comptent pas dans le calcul du Tm.
B. Clonage sans enzymes de restriction : assemblage Gibson
Le plasmide est linéarisé par digestion par des enzymes de restriction puis par amplification PCR. L’assemblage du
plasmide et des fragments à cloner se fait selon la réaction d’assemblage Gibson. La seule contrainte de cette
méthode est qu’il faut des extrémités communes entre le plasmide et l’insert. Pour cela, on insère ces extrémités
communes par amplification PCR. Cet assemblage Gibson repose sur 3 activités enzymatiques : une exonucléase 5’3’
(grignote les extrémités), une ADN polymérase (remplit les trous) et une ADN ligase.
C’est une méthode rapide qui ne nécessite pas d’ER ni de beaucoup d’ADN de départ. Il n’y a pas de cicatrice de
restriction et il est possible d’assembler plus de 6 fragments simultanément.
3. Transformation artificielle de bactéries
Elle peut se faire par transformation chimique avec des bactéries chimio compétentes. Les bactéries sont en
suspension dans une solution de CaCl2 ; les cations divalents attirent les molécules de plasmides à la membrane. Le
choc thermique (augmentation de T° pour faire des trous dans la membrane) favorise alors le transit de l’ADN
exogène.
Elle peut également se faire par électroporation avec bactéries électro compétentes. Le choc électrique transitoire
génère des trous dans la paroi.
Une fois qu’on a transformé les bactéries, il faut extraire l’ADN plasmidique du plum bactérien et s’assurer que le
plasmide produit présente toutes les propriétés voulues de la séquence insérée. Une fois que c’est fait, on peut
entamer la transgénèse.
III. Transgénèse
Un organisme transgénique est un organisme porteur d’une modification génétique héritable créée suite au
transfert artificiel d’un ADN exogène séquence génomique modifiée à un endroit. L’ADN exogène doit s’intégrer
dans un chromosome (perte d’un ADN circulaire libre au cours des divisions cellulaires) et le chromosome modifié
doit être transmis à la descendance (ie l’ADN exogène est intégré dans le génome avant la formation de la lignée
germinale. Pour cela, on a deux possibilités :
Introduire l’ADN exogène dans l’embryon précoce avant la formation des cellules de la lignée germinale ;
Introduire l’ADN exogène dans des cellules pluripotentes (cellules souches embryonnaires isolées de la masse
interne du blastocyste ou cellule souches pluripotentes induites issus de la reprogrammation de cellules somatiques
adultes = dédifférenciation).
Ingénierie du génome
B.Horard
I. Introduction
Il s’agit d’ajouter, d’enlever ou d’altérer une séquence d’ADN dans un organisme.
1. Pourquoi modifier le génome ?
Cela nous permet de comprendre le fonctionnement des gènes : caractérisation in vivo du fonctionnement des
gènes. Cela permet également de traiter/prévenir une pathologie associée à une mutation dans le génome (étude du
développement pathologique, pallier un défaut génétique, corriger une erreur) ou d’apporter un trait d’intérêt
économique (intérêt physiologique = résistance à un pathogène, croissance… et intérêt économique = trait physique
à la valeur ajoutée, production de protéines recombinantes…)
2. Comment faire cette modification du génome ?
Il faut identifier et isoler la séquence d’intérêt, ce qui correspond à la phase de clonage : on isole donc, puis on clone
et on insère dans un vecteur de transgénèse que l’on fait se multiplier et que l’on purifie et séquence ensuite. Puis, il
faut transférer le vecteur de transgénèse dans un organisme receveur, ce qui correspond à la transgénèse. Cette
transgénèse peut se faire par micro-injection dans un embryon précoce, dans le pronucléus mâle (les deux donnant
un individu transgénique) ou par transfection de cellules souches embryonnaires (micro injectées dans un
blastocyste puis réimplantation dans l’oviducte : on obtient une femelle pseudo-gravide qui donnera naissance à une
chimère).
II. Clonage de l’ADN
1. Identifier et isoler la séquence d’intérêt
Le matériel de départ correspond à un génome partiellement séquencé (ADN génomique ou cDNA). Il peut être isolé
par PCR, ce qui nous permet d’obtenir 2n copies du fragment d’intérêt, ou par synthèse de novo complète (in vitro) :
on part d’une séquence connue, on va réaliser des petits fragments de séquence qu’on va assembler par
chevauchement pour reformer le la séquence complète.
2. Clonage
A. Le clonage traditionnel avec enzymes de restriction
Il y a premièrement digestion de l’ADN par des enzymes de restriction au niveau des sites cibles de ces
endonucléases. Les enzymes génèrent des extrémités franches ou cohésives dues au palindrome lui-même. Il y a
ensuite formation d’un vecteur assemblé par ligature du fragment et d’un vecteur par l’ADN ligase après séparation
, sur gel d’agarose et purification des fragments sur colonne de silice. Le vecteur utilisé pour créer le vecteur assemblé
provient d’un plasmide possédant des sites multiples de clonage (MCS), une origine bactérienne et des gènes de
sélection bactérienne. Ce plasmide est ouvert, et afin d’éviter qu’il ne se referme sur lui-même, il faut modifier ses
extrémités par déphosphorylation à l’aide d’une phosphatase. A l’issue de ces manipulations, il est donc utilisable
comme vecteur pour recevoir le fragment à cloner.
Si on n’a pas de sites d’enzymes de restriction qui nous intéresse pour l’étape de clonage dans le vecteur, il faut
ajouter au préalable des sites de restriction par amplification PCR aux extrémités du fragment d’intérêt (du côté 5’
des amorces). NB : les bases ajoutées ne comptent pas dans le calcul du Tm.
B. Clonage sans enzymes de restriction : assemblage Gibson
Le plasmide est linéarisé par digestion par des enzymes de restriction puis par amplification PCR. L’assemblage du
plasmide et des fragments à cloner se fait selon la réaction d’assemblage Gibson. La seule contrainte de cette
méthode est qu’il faut des extrémités communes entre le plasmide et l’insert. Pour cela, on insère ces extrémités
communes par amplification PCR. Cet assemblage Gibson repose sur 3 activités enzymatiques : une exonucléase 5’3’
(grignote les extrémités), une ADN polymérase (remplit les trous) et une ADN ligase.
C’est une méthode rapide qui ne nécessite pas d’ER ni de beaucoup d’ADN de départ. Il n’y a pas de cicatrice de
restriction et il est possible d’assembler plus de 6 fragments simultanément.
3. Transformation artificielle de bactéries
Elle peut se faire par transformation chimique avec des bactéries chimio compétentes. Les bactéries sont en
suspension dans une solution de CaCl2 ; les cations divalents attirent les molécules de plasmides à la membrane. Le
choc thermique (augmentation de T° pour faire des trous dans la membrane) favorise alors le transit de l’ADN
exogène.
Elle peut également se faire par électroporation avec bactéries électro compétentes. Le choc électrique transitoire
génère des trous dans la paroi.
Une fois qu’on a transformé les bactéries, il faut extraire l’ADN plasmidique du plum bactérien et s’assurer que le
plasmide produit présente toutes les propriétés voulues de la séquence insérée. Une fois que c’est fait, on peut
entamer la transgénèse.
III. Transgénèse
Un organisme transgénique est un organisme porteur d’une modification génétique héritable créée suite au
transfert artificiel d’un ADN exogène séquence génomique modifiée à un endroit. L’ADN exogène doit s’intégrer
dans un chromosome (perte d’un ADN circulaire libre au cours des divisions cellulaires) et le chromosome modifié
doit être transmis à la descendance (ie l’ADN exogène est intégré dans le génome avant la formation de la lignée
germinale. Pour cela, on a deux possibilités :
Introduire l’ADN exogène dans l’embryon précoce avant la formation des cellules de la lignée germinale ;
Introduire l’ADN exogène dans des cellules pluripotentes (cellules souches embryonnaires isolées de la masse
interne du blastocyste ou cellule souches pluripotentes induites issus de la reprogrammation de cellules somatiques
adultes = dédifférenciation).
