3e Bachelor Bio-ingenieurswetenschappen: cel- en
gentechnologie
Academiejaar 2013-2014
Microbieel Ecologische
Processen
, Nitrificerende activiteit
1 Inleiding
Nitrificatie is een belangrijk ecologisch proces, uitgevoerd door micro-organismen, waarbij
ammonium (NH4+) geoxideerd wordt tot nitraat (NO3-). In een eerste stap wordt ammonium
geoxideerd tot nitriet door ammoniumoxiderende bacteriën zoals Nitrosomonas en Nitrosospira
(vgl.1). Dit zijn chemo-autotrofe bacteriën die CO2 fixeren tot organische componenten en hun
energie hiervoor halen uit de oxidatie van ammonium. De tweede stap in de nitrificatie is de
omzetting van nitriet naar nitraat door nitrietoxiderende bacteriën zoals Nitrobacter en Nitrospira
(vgl. 2). Deze bacteriën zijn ook chemo-autotroof maar halen hun energie voor CO2 fixatie uit de
oxidatie van nitriet.
2 NH4+ + 3 O2 2 NO2- + 2 H20 + 4 H+ (vgl. 1)
2 NO2- + O2 2 NO3- (vgl. 2)
Nitrificatie is een belangrijk proces in de bodem omdat het de gefixeerde stikstof onder de vorm
van ammonium terug vrijmaakt voor assimilatie door planten, en dit onder de vorm van nitraat.
Daarnaast wordt nitrificatie ook als toepassing gebruikt in de waterzuivering waar het proces
gecombineerd wordt met denitrificatie (NO3- NO2- N2) om stikstof te verwijderen uit het
water.
In dit experiment wordt de nitrificerende activiteit van micro-organismen op verschillende
bodemstalen (onbehandeld en met additieven) nagegaan. De nitrificerende activiteit is de
snelheid waarmee nitriet omgezet wordt tot nitraat en is de snelheidsbepalende stap.
2
, 2 Materiaal en methoden
De nitrificerende activiteit van microbiële populaties wordt bepaald door nitriet toe te voegen
aan een bodemstaal en daarna de snelheid te meten waarmee nitriet verdwijnt. Omdat
ammoniumoxiderende bacteriën ook nitriet produceren, wordt nitrapyrine aan het staal
toegevoegd. Dit is een gechloreerde verbinding van 2-methylpyridine (bactericide) en zorgt voor
activiteitsinhibitie van ammoniumoxiderende bacteriën.
Voorbehandeling
Ongeveer 10 g onbehandelde A-horizont grond (bovenste humuslaag van de bodem) werd
gesuspendeerd in 50 mL fosfaatbuffer (10 mM) en ~ 30 seconden geschud. Daarna werd 1 mL
nitrapyrineoplossing (1 g/L) en vervolgens 1 mL nitriet stockoplossing (1 g NO2--N/L)
toegevoegd.
Staalname
Er werd 5 mL van de suspensie gefiltreerd over een plooifilter en opgevangen. Het filtraat werd
verdund (1/8) door aan 1 mL filtraat 7 mL gedestilleerd water toe te voegen. De suspensie werd
daarna 7 dagen bewaard, waarna het opnieuw gefiltreerd werd. Dit filtraat werd 1/4 verdund door
aan 1 mL filtraat 3 mL gedestilleerd water toe te voegen. Beide filtraten (t=0, t=48h) werden
tenslotte verder geanalyseerd om het gehalte aan nitriet te bepalen.
Nitrietbepaling (Montgomery & Dymock)
De bepaling van het gehalte nitriet gebeurt aan de hand van de methode van Montgomery en
Dymock. Hierbij ondergaat nitriet een chemische transformatie waardoor een roze kleur ontstaat
die spectofotometrisch gemeten kan worden. Aan de hand van een standaardreeks kan vervolgens
de concentratie aan nitriet in het staal bepaald worden.
Aan 2 mL van het verdund filtraat werd 2.5 mL van een mengsel van KHSO4 (27.2 g/L) en
sulfanilzuur (3.46 g/L) toegevoegd. Er werd 10 minuten gewacht en vervolgens werd er 2.5 mL
N(1-naphtyl)ethyleendiaminehydrochloride (0.04%) toegevoegd. Na 10 minuten wachten werd
alles aangelengd tot 50 mL met gedestileerd water. De oplossing is roze gekleurd en kan gemeten
worden met de spectrofotometer.
3
gentechnologie
Academiejaar 2013-2014
Microbieel Ecologische
Processen
, Nitrificerende activiteit
1 Inleiding
Nitrificatie is een belangrijk ecologisch proces, uitgevoerd door micro-organismen, waarbij
ammonium (NH4+) geoxideerd wordt tot nitraat (NO3-). In een eerste stap wordt ammonium
geoxideerd tot nitriet door ammoniumoxiderende bacteriën zoals Nitrosomonas en Nitrosospira
(vgl.1). Dit zijn chemo-autotrofe bacteriën die CO2 fixeren tot organische componenten en hun
energie hiervoor halen uit de oxidatie van ammonium. De tweede stap in de nitrificatie is de
omzetting van nitriet naar nitraat door nitrietoxiderende bacteriën zoals Nitrobacter en Nitrospira
(vgl. 2). Deze bacteriën zijn ook chemo-autotroof maar halen hun energie voor CO2 fixatie uit de
oxidatie van nitriet.
2 NH4+ + 3 O2 2 NO2- + 2 H20 + 4 H+ (vgl. 1)
2 NO2- + O2 2 NO3- (vgl. 2)
Nitrificatie is een belangrijk proces in de bodem omdat het de gefixeerde stikstof onder de vorm
van ammonium terug vrijmaakt voor assimilatie door planten, en dit onder de vorm van nitraat.
Daarnaast wordt nitrificatie ook als toepassing gebruikt in de waterzuivering waar het proces
gecombineerd wordt met denitrificatie (NO3- NO2- N2) om stikstof te verwijderen uit het
water.
In dit experiment wordt de nitrificerende activiteit van micro-organismen op verschillende
bodemstalen (onbehandeld en met additieven) nagegaan. De nitrificerende activiteit is de
snelheid waarmee nitriet omgezet wordt tot nitraat en is de snelheidsbepalende stap.
2
, 2 Materiaal en methoden
De nitrificerende activiteit van microbiële populaties wordt bepaald door nitriet toe te voegen
aan een bodemstaal en daarna de snelheid te meten waarmee nitriet verdwijnt. Omdat
ammoniumoxiderende bacteriën ook nitriet produceren, wordt nitrapyrine aan het staal
toegevoegd. Dit is een gechloreerde verbinding van 2-methylpyridine (bactericide) en zorgt voor
activiteitsinhibitie van ammoniumoxiderende bacteriën.
Voorbehandeling
Ongeveer 10 g onbehandelde A-horizont grond (bovenste humuslaag van de bodem) werd
gesuspendeerd in 50 mL fosfaatbuffer (10 mM) en ~ 30 seconden geschud. Daarna werd 1 mL
nitrapyrineoplossing (1 g/L) en vervolgens 1 mL nitriet stockoplossing (1 g NO2--N/L)
toegevoegd.
Staalname
Er werd 5 mL van de suspensie gefiltreerd over een plooifilter en opgevangen. Het filtraat werd
verdund (1/8) door aan 1 mL filtraat 7 mL gedestilleerd water toe te voegen. De suspensie werd
daarna 7 dagen bewaard, waarna het opnieuw gefiltreerd werd. Dit filtraat werd 1/4 verdund door
aan 1 mL filtraat 3 mL gedestilleerd water toe te voegen. Beide filtraten (t=0, t=48h) werden
tenslotte verder geanalyseerd om het gehalte aan nitriet te bepalen.
Nitrietbepaling (Montgomery & Dymock)
De bepaling van het gehalte nitriet gebeurt aan de hand van de methode van Montgomery en
Dymock. Hierbij ondergaat nitriet een chemische transformatie waardoor een roze kleur ontstaat
die spectofotometrisch gemeten kan worden. Aan de hand van een standaardreeks kan vervolgens
de concentratie aan nitriet in het staal bepaald worden.
Aan 2 mL van het verdund filtraat werd 2.5 mL van een mengsel van KHSO4 (27.2 g/L) en
sulfanilzuur (3.46 g/L) toegevoegd. Er werd 10 minuten gewacht en vervolgens werd er 2.5 mL
N(1-naphtyl)ethyleendiaminehydrochloride (0.04%) toegevoegd. Na 10 minuten wachten werd
alles aangelengd tot 50 mL met gedestileerd water. De oplossing is roze gekleurd en kan gemeten
worden met de spectrofotometer.
3
