Summary
Samenvatting Plant Molecular Genetics and Plant Biotechnology
- Course
- Institution
Samenvatting van heel het semester (omvat alles: slides + eigen woorden van de professor)
[Show more]
1 review
By: imurat97 • 1 month ago
Seller
Follow
sarahvanvolsem
Reviews received
Content preview
Sarah VanvolsemPlant molecular genetics and plant biotechnology
Plant transformation 1: Agrobacterium – plant cell interaction
Inhoud
The Agrobacterium/plant cell interaction
Agrobacterium tumefaciens – pathogen and useful tool
The Tumour inducing principle (TIP)
Genes carried by the T-DNA in natural A.tumefaciens isolates
The concept of ‘genetic colonization’
The Ti-plasmid
VirA/VirG two-component transcriptional regulation system
Generating the T-strand
The immature T-complex
Export of the T-complex from the A.
Assembly of the mature T-DNA complex
T-DNA integration
A.tumefaciens is een gram neg bacterie van de Rhizobiaceae familie die we gebruiken om
transformatie in planten te verwezenlijken. De interactie hiertussen heeft ons veel geleerd hoe
planten functioneren. Men bekijkt de moleculaire details hiervan.
A.tumefaciens is een plantpathogeen, ttz het veroorzaakt kroongallen/tumoren, dit doordat ze de
mogelijkheid heeft om DNA te transfereren in de plantencel. Tumoren w het meest gevonden op de
kroon van de plant (junction root-stem), de stem zelf en de superficial roots. Deze tumoren kunnen
prolifereren op een medium zonder fytohormonen, en zelfs in de afwezigheid van de bacterie. Dit is
het verschil met een callus.
Wat is een callus? Callus cellen zijn ongedifferentieerde cellen die de wonde
van een plant omgeven ≠ tumor. Als je een petrischaal hebt en je gaat daar
een auxine en een cytokine aan toevoegen (respect. 2,4- dichlorophenoxy
acetic acid, en zeatin) => dan zullen aan de rand van de leaves cellen
prolifereren en resulteren zoals in de foto. Maaaar de toevoeging van deze
hormonen zijn nodig, omdat deze de celdeling stimuleren (cytokines en
auxines)!! Dit is niet nodig bij een tumor.
Hoe gzn dat een bacterie tumoren veroorzaakt?
A.tumefaciens veroorzaakt plantenziekte => gevonden in 1907. Ze deden een experiment: ze starten
met een madeliefje met een tumor. Hieruit konden ze bacteriën isoleren en laten groeien op een
petriplaat. Toen inoculeerde ze deze bacteriën op een gezonde plant => er vormde tumoren op de
gezonde plant.
Tumor inducing principle (TIP)?
Er werd ondervonden dat er geen virus meespeelden, maar een plasmide. Men bestudeerde 2
stammen, nl een virulente en gn virulente => er werd gezien dat de virulente stam een groot plasmide
bevatte (oorzaak van tumoren). Om te zien of het plasmide de oorzaak is van de tumoren, werd het
plasmide getransfereerd naar een acceptor, avirulent strain. Dit bewees TIP! Plasmide heet drm
Tumor inducing of simpelweg Ti plasmide.
Later werd ook in de tumoren zelf DNA gevonden, nl T-DNA => dit bewees dus dat een deel van Ti
plasmide getransfereerd w in plantencellen == Interkingdom DNA transfer.
Eind jaren 70 wist men hoe de vorming v kroongallen gebeurde: A.tumefaciens bevatten Ti plasmide,
bevattende T-DNA die getransfereerd kan worden naar plantengenen, dit via wonden (crown, stem,
1
,Sarah Vanvolsem
roots). Een kopie van deze T-DNA w getransfereerd => w uiteindelijk geïncorporeerd in
plantenchromosoom. Expressie van deze genen is dan verantwoordelijk voor vorming v kroongallen.
Genen op T-DNA?
- Ipt (isopentenyl transferase) => zorgt voor de biosynthese van een cytokinine. Hoe werkt
deze? Deze plaatst eenisopentenyl groep oop een AMP molecule. Ook bestaat de
hydroxylated vorm, deze heet zeatine = meest belangrijke natuurlijke cytokinine en is afgeleid
uit adenine.
- iaaM & iaaH => zorgen voor de biosynthese van auxines.
Auxine en cytokine overproductie zorgen voor tumorvorming.
De cel deelt en de dochtercellen zullen ook T-DNA bevatten, aldus zullen ze ook auxines (indole
acetic acid = natuurlijke auxine) en cytokines vormen.
Zie slide 14
Fysiologische influence van deze 2 hormonen: tobacco plant: y-as: cytokinine, x-as: auxine.
Op een medium bij hoge conc van beide, dan krijg je vorming van een callus (ongedifferentieerde
cellen).
Hoge cytokinine, en lage auxine, dan krijg je shoots
Hoge auxine en geen cytokinine, dan krijg je roots
Slide 18
- Octopine synthase, nopaline synthase, lysopine synthase… zijn genen die instaan voor de
opine biosynthese.
o Ocs => katalyseert de condensatie van Arginine met pyruvaat en geeft octopine.
o Nos => katalyeert de condensatie van arginine met -ketoo glutaraat en geeft
nopaline.
Deze opines zijn suiker of AZ derivaten die geproduceerd w in de kroongallen en gesecreteerd
w => deze stoffen kunnen fungeren als voedingsbron voor Agro (N -en C bron), maw Agroo
haalt hier voordelen uit.
Wrm kan A.tumefaciens specifiek deze bronnen gebruiken?
Agro bevat katabolische genen voor opine biosynthese genen op zijn Ti plasmid (buiten T-
DNA). Zo kunnen ze deze producten afbreken en verbruiken.
Maw Agro zal de plant genetisch modificeren om een soort v productiefabriek voor opines
te worden, deze w dan verbruikt door Agro als C -en N bron.
!! regulatorische signalen van die T-DNA genen. Deze genen komen van een bacteriele plasmide, maar
deze w pas overgeschreven indien overgeschreven in een plant (na incorporatie), aldus bevat T-DNA
een promoter die enkel actief is in plantencellen. Eukaryotische genen hebben ook een polyadenylatie
signaal (voor vorming v poly A staart) nodig om functioneel mRNA te vormen (niet in prokaryote
genen) => deze zijn ook aanwezig op T-DNA => hypothese dat T-DNA wss evolutionair overgegeven is
v plant naar bacterie.
Virulentiegenen vind je ook telkens terug op de Ti plasmid, deze zijn nodig voor transfermachinerie te
produceren. Zonder deze kan er niet aan transfer v DNA gdn w.
Ander voorbeeld v Ti plasmid: deze bevat split TDNA’s, ttz 2 TDNA’s, beide bevatten een linker en
rechter border. Zie slide 22 & 23
Wat vind je op Ti plasmid?
- LR en RB = 25 bp imperfect direct repeats, dwz deze zitten in dezelfde oriëntatie (≠inverted).
2
,Sarah Vanvolsem
Voorbeeld: TTAG NNN TTAG, dus een sequentie dat herhaald w op dezelfde manier
downstream. Imperfect omdat ze niet identiek zijn.
- De virulentie (vir) regioo, bestaat uit meerdere vir operons. Deze bevinden zich buiten T-DNA.
Deze staan in voor proteïnen voor de vorming v secretiesysteem.
- Katabolische genen => laat toe om opines af te breken en te verbruiken
- Chromosomal virulentiegenen => Chv, codeert voor proteinen die zorgen voor de
aanhechting van A.tumefaciens en verwonde plantencel.
Transformatie verloop in verschillende fasen?
- Aantrekking v A.tumefaciens naar plantenwondes == vorm v chemotaxis. Moleculen w
gesecreteerd door verwonde plantencellen, dit zijn AZ, fenolen (degradeer producten van
lignine (in celwand)).
- Aanhechting aan plantencel (op een polaire manier). Hierbij zijn proteïnen betrokken.
Proteïnen hechten aan elkaar, hence zorgen voor de aanhechting van de organismen. Welke
proteïnen? chvA, chvB… die binden op plantenreceptoren.
VirA/VirG two component transcriptional regulation system?
- Activatie van Ti plasmid virgenen. Enkel wnr A.tumefaciens in de buurt is van zo een
verwonde plantencel zullen die virgenen geactiveerd w.
VirA/VirG => VirA is een sensor, zal bepaalde moleculen, gesecreteerd door
plantencel, aanvoelen. 1 van die producten = acetosyringone (w in grote kwantiteiten
geproduceerd in verwonde tobacco planten). Deze producten binden met VirA
proteïne (in inner membraine van A.tumefaciens). Vir A is een dimeer en heeft een site voor
de gesecreteerde plant derived phenolic compounds (deze inducerende moleculen zijn niet
plant species specific). Wnr deze compounds binden => comf verandering v virA =>
3
, Sarah Vanvolsem
autofosforylatie van virA. Fosfaat kan dan overgedragen w naar VirG => dan w deze actief
(actieve transcriptiefactor). Deze bindt dan op promoterregio van de vir operons. Maw in
elke promoter vind je een virbox waar gefosforyleerde virG op bindt => activeert vir
operons.
Nogmaals: virA = sensor en vir G = transcriptieactivator!
Vir A en Vir G moeten altijd present zijn in A.tumefaciens (want ja vir A moet moleculen gaan
sensoren). Deze w dus altijd uitgedrukt in lage conc in A.tumefaciens (maw deze staan achter een
constitutieve promoter). Al de andere virgenen w enkel uitgedrukt na inductie, aldus id buurt van
verwonde plantencel.
Generating the T-strand?
De molecule die overgedragen w naar de plantencellen is een single stranded T-DNA kopie == T strand.
Single strand breaks zullen geïnduceerd w in linker/rechter border door VirD1/VirD2. VirD1 scheidt de
2 DNA strengen. VirD2 is de proteïne die de nicks (single strand break op bottom strand (3’)
introduceert. Links zie je virD2 (hierin zit tyrosine die fosfodiesterbinding gaat aanvallen =>
transestherinfication, maw ester bond breekt en een nieuwe esterbinding w gevormd). Als resultaat
krijg je een 3’ hydroxyl en aan 5’ krijg je een virD2 proteïne. Nicking gebeurt strand specific (onderste
streng) en sequentie specifiek.
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sarahvanvolsem. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $11.76. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
56326 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now