Hoofdstuk 7: de celcultuuromgeving
-> artificiële omgeving, waarin de groei- en proliferatievereisten van de cellen zo goed mogelijk nagebootst worden
7.2 Co2-incubatoren
Cellen groeien optimaal in een aangepaste atmosfeer bij constante temperatuur, 5-10% Co2 en een hoge
relatieven vochtigheid (>95%)
Door gebruik van incubator kunnen deze parameters geregeld en opgevolgd worden
Types
Luchtmantelverwarming
Sneller beoogde temperatuur
Lichter
Bij eventuele stroompanne: warmte sneller verliezen + temperatuur niet homogeen verdeeld
Watermantelverwarming
Duurt langer om de kamer op te warmen
Zwaarder want ze moeten met water gevuld worden
Bij eventuele stroompanne: temperatuur zal langer behouden worden + temperatuur homogeen
verdeeld
Temperatuur
Meestal 37°C, koudbloedige vertebraten: 18-24°C
Controle: thermometer in de kamer met display aan buitenkant van de deur
Co2
Noodzakelijk voor behoud van pH medium dat vaak bicarbonaat gebufferd is
Co2 regulatie met interne sensor bv.: infrarode sensor (meest gevoelig en accuraat), ondervind geen invloed
door veranderingen in vochtigheid en temperatuur
o Te laag: opening inwendige klep, tekort aanvullen
o Kalibratie soms nodig
Vochtigheid
Pan met water onderaan, water verdampt en wordt via luchtcirculatie gelijkmatig verdeeld (schappen zijn
geperforeerd)
Hoge vochtigheidgraad: nodig voor osmolariteit van cellen op peil te houden
Grotere kans op microbiële contaminatie: gedemeniraliseerd water en wekelijks schoonmaken
Desinfectie en sterilisatie
CuSO4 tegen schimmels in het water (verspreiding)
Losse onderdelen worden gedesinfecteerd met 70% ethanoloplossing
o Soms ook via UV-lampen of peroxide dampen
Nieuwere incubatoren: sterilisatie met hete lucht (160-180°C)
Binnenkamer van koper is ook een optie
7.3 Laminaire luchtstroomkast (Laminaire Airflow of LAF-kast)
Lucht kan horizontaal of verticaal over het werkopp. geblazen worden
Steriele werkomgeving: lucht filteren van buiten af met HEPA-filter (High Efficiency Particulate Air)
Micro-organismen kunnen hierop niet overleven, andere deeltjes kunnen niet door deze filter
In EU geklasseerd volgens MPPS (most penetrating particle size)
Laminaire luchtstroom genereren, laminair airflow, snelheid van 0.45m/s
o Parallele stroomlijnen die een gegeven volume opvullen waardoor niks de omgeving kan binnendringen
of verlaten
o Bij horizontale luchtstroomkast: lucht blazen van achter
o Bij verticale luchtstroomkast: lucht blazen van bovenaf
, Horizontale luchtstroomkasten blazen de lucht, gevuld met aerosolen vanuit de kast in het gezicht van de
operator
o Ongeschikt voor werken met toxische of biologisch gevaarlijke agentia => zelden gebruik bij dierlijke
celkweek
Jaarlijks onderhoud:
o Controle op effectiviteit van desinfectieprocedures m.b.v. contactafdrukken m.b.v. Rodac-plaatjes
o Meten van luchtsnelheid en effectiviteit van hoofdfilter: gespecialisseerd bedrijf
Verticale luchtstroomkast: Indeling in klassen
Klasse I
o Bescherming: operator en omgeving
o Geen bescherming van het product
o Geen laminaire luchtstroom in de werkruimte
o 1 HEPA-filter
Klasse II
o Bescherming: operator, omgeving en product
o Steriele laminaire luchtstroom in de werkruimte
o 2 HEPA-filters
Klasse III
o Bescherming: operator, omgeving en product
o Volledig afgesloten van de omgeving: handschoenpoorten of luchtslot
o Onhandig: alleen gebruik bij risicoklasse 4 micro-organismen zoals Ebola Virus
Werken in een laminaire luchtstroomkast
10 minuten voor werkzaamheden aanzetten
Respecteer de werkhoogte glazenplaat
Werkoppervlak eerst met 70% ethanol ontsmetten, UV-lamp kan ook gebruikt worden
Opstelling
o Centrale open werkruimte
o Geen materiaal verborgen van oogpunt
7.4 Licht- en fluorescentiemicroscopie
Geïnventeerde fase-contrast microscoop
Bovenaan: lichtbron en condensor
Onderaan: objectieven
Systeem van ringen in de condensor en in het objectief wordt, door faseverschil te creëren, het beeld versterkt
ten opzichte van de achtergrond
Bij fasecontrast => niet nodig om de cellen te kleuren
Epifluorescentie
Fluorescerende stof (fluorofoor of fluorochroom)
o Exidatie met monochromatisch licht (korte golflengt, bv. blauw licht)
o Uitzenden van licht met langere golflengte, bv. groen licht
Toepassingen:
o Immunohistochemie (bv. eiwitten)
o In situ hybridisatie (nucleïnezuren)
GFP
= Green Fluorescent Protein (afkomstig van kwal Aequorea victoria)
Enchanged GFP of eGFP geeft sterker signaal dan wild-type GPF
Om dierllijke cellen in situ te bekijken met fluorescentie
Groene fluorescentie als ze worden blootgesteld aan blauw licht
Kleurmutanten: BGFP (blue), CGFP (cyan), YGFP (yellow)
-> artificiële omgeving, waarin de groei- en proliferatievereisten van de cellen zo goed mogelijk nagebootst worden
7.2 Co2-incubatoren
Cellen groeien optimaal in een aangepaste atmosfeer bij constante temperatuur, 5-10% Co2 en een hoge
relatieven vochtigheid (>95%)
Door gebruik van incubator kunnen deze parameters geregeld en opgevolgd worden
Types
Luchtmantelverwarming
Sneller beoogde temperatuur
Lichter
Bij eventuele stroompanne: warmte sneller verliezen + temperatuur niet homogeen verdeeld
Watermantelverwarming
Duurt langer om de kamer op te warmen
Zwaarder want ze moeten met water gevuld worden
Bij eventuele stroompanne: temperatuur zal langer behouden worden + temperatuur homogeen
verdeeld
Temperatuur
Meestal 37°C, koudbloedige vertebraten: 18-24°C
Controle: thermometer in de kamer met display aan buitenkant van de deur
Co2
Noodzakelijk voor behoud van pH medium dat vaak bicarbonaat gebufferd is
Co2 regulatie met interne sensor bv.: infrarode sensor (meest gevoelig en accuraat), ondervind geen invloed
door veranderingen in vochtigheid en temperatuur
o Te laag: opening inwendige klep, tekort aanvullen
o Kalibratie soms nodig
Vochtigheid
Pan met water onderaan, water verdampt en wordt via luchtcirculatie gelijkmatig verdeeld (schappen zijn
geperforeerd)
Hoge vochtigheidgraad: nodig voor osmolariteit van cellen op peil te houden
Grotere kans op microbiële contaminatie: gedemeniraliseerd water en wekelijks schoonmaken
Desinfectie en sterilisatie
CuSO4 tegen schimmels in het water (verspreiding)
Losse onderdelen worden gedesinfecteerd met 70% ethanoloplossing
o Soms ook via UV-lampen of peroxide dampen
Nieuwere incubatoren: sterilisatie met hete lucht (160-180°C)
Binnenkamer van koper is ook een optie
7.3 Laminaire luchtstroomkast (Laminaire Airflow of LAF-kast)
Lucht kan horizontaal of verticaal over het werkopp. geblazen worden
Steriele werkomgeving: lucht filteren van buiten af met HEPA-filter (High Efficiency Particulate Air)
Micro-organismen kunnen hierop niet overleven, andere deeltjes kunnen niet door deze filter
In EU geklasseerd volgens MPPS (most penetrating particle size)
Laminaire luchtstroom genereren, laminair airflow, snelheid van 0.45m/s
o Parallele stroomlijnen die een gegeven volume opvullen waardoor niks de omgeving kan binnendringen
of verlaten
o Bij horizontale luchtstroomkast: lucht blazen van achter
o Bij verticale luchtstroomkast: lucht blazen van bovenaf
, Horizontale luchtstroomkasten blazen de lucht, gevuld met aerosolen vanuit de kast in het gezicht van de
operator
o Ongeschikt voor werken met toxische of biologisch gevaarlijke agentia => zelden gebruik bij dierlijke
celkweek
Jaarlijks onderhoud:
o Controle op effectiviteit van desinfectieprocedures m.b.v. contactafdrukken m.b.v. Rodac-plaatjes
o Meten van luchtsnelheid en effectiviteit van hoofdfilter: gespecialisseerd bedrijf
Verticale luchtstroomkast: Indeling in klassen
Klasse I
o Bescherming: operator en omgeving
o Geen bescherming van het product
o Geen laminaire luchtstroom in de werkruimte
o 1 HEPA-filter
Klasse II
o Bescherming: operator, omgeving en product
o Steriele laminaire luchtstroom in de werkruimte
o 2 HEPA-filters
Klasse III
o Bescherming: operator, omgeving en product
o Volledig afgesloten van de omgeving: handschoenpoorten of luchtslot
o Onhandig: alleen gebruik bij risicoklasse 4 micro-organismen zoals Ebola Virus
Werken in een laminaire luchtstroomkast
10 minuten voor werkzaamheden aanzetten
Respecteer de werkhoogte glazenplaat
Werkoppervlak eerst met 70% ethanol ontsmetten, UV-lamp kan ook gebruikt worden
Opstelling
o Centrale open werkruimte
o Geen materiaal verborgen van oogpunt
7.4 Licht- en fluorescentiemicroscopie
Geïnventeerde fase-contrast microscoop
Bovenaan: lichtbron en condensor
Onderaan: objectieven
Systeem van ringen in de condensor en in het objectief wordt, door faseverschil te creëren, het beeld versterkt
ten opzichte van de achtergrond
Bij fasecontrast => niet nodig om de cellen te kleuren
Epifluorescentie
Fluorescerende stof (fluorofoor of fluorochroom)
o Exidatie met monochromatisch licht (korte golflengt, bv. blauw licht)
o Uitzenden van licht met langere golflengte, bv. groen licht
Toepassingen:
o Immunohistochemie (bv. eiwitten)
o In situ hybridisatie (nucleïnezuren)
GFP
= Green Fluorescent Protein (afkomstig van kwal Aequorea victoria)
Enchanged GFP of eGFP geeft sterker signaal dan wild-type GPF
Om dierllijke cellen in situ te bekijken met fluorescentie
Groene fluorescentie als ze worden blootgesteld aan blauw licht
Kleurmutanten: BGFP (blue), CGFP (cyan), YGFP (yellow)
