Summary
samenvatting methoden in het biomedisch onderzoek 2
- Course
- Institution
samenvatting van alle leerstof van methoden in het biomedisch onderzoek 2. Door dit document te leren haalde ik in eerste zit een 17/20.
[Show more]
4 reviews
By: yanabaert1 • 11 months ago
By: lienvd80 • 11 months ago
By: emreozturk • 2 months ago
By: camillecarette • 2 year ago
Seller
Follow
JenteDG
Reviews received
Content preview
HOOFDSTUK 1: ANALYSE VAN RNARNA VOORZORGEN EN BEWAREN
1) Problemen
→ Staalname => verandering RNA profiel
→ RNA degradatie > endogeen/ exogeen (RNAse)
→ DNA contaminatie
2) Staalname
→ Anticoagulans = EDTA (niet heparine > inhibitie)
→ RNA stabilisatie
− Invriezen in N
− Bewaarmiddel = PAXgene (bloed), RNAlater (cel), Trizol (weefsel)
3) Staalverwerking/ bewaring
→ RNAse vrij => DEPC (carcinogeen), andere inhibitoren
→ Nuclease vrije oplossingen
→ 1 jaar op -80°C
→ Langer: alcoholprecipitaat
4) DNA contaminatie
→ Enkel probleem als onderscheid nodig is
→ Detectie = RT – controle/ elektroforese
→ Verwijderen: DNAse behandeling => verlies RNA mogelijk
RNA EXTRAHEREN
→ Afh v startmateriaal en doel
1) Lysis => °lysaat
→ Remmers ongewenste moleculen
→ Detergenten
→ Vriezen en ontdooien => cryopreservatie nodig
→ Mechanisch: pestel/ beads
→ Vloeibaar: glazen pestels, mild, organellen intact
→ Sonicatie: DNA/RNA mee fragmenteren
2) Isoleren => RNA uit lysaat halen
→ Organische solventen = trizol
− Zuur => breekt DNA af
− Guanidium thiocyanaat => lysis + inhibitie RNAse
− Goede opbrengst + zuiverheid
→ Alcoholprecipitatie => RNA uit waterlaag
− Zout (Na-acetaat) + alcohol (ethanol/isopropanol) => neerslaan RNA
− Terug oplossen in water/ buffer
− Lage conc => lage T/ glycogeen toevoegen
→ Kolomchromatografie => RNA uit waterlaag
− Silica kolom: selectieve binding RNA > buffer
− Elutie > water/ buffer
− Goede zuiverheid <-> beperkte opbrengst
− Chaotrope zouten in buffer => nuclease inhibitie
, 3) Oplossen => gewenste hoeveelheid
→ Alcoholprecipitatie/ kolom => ook opzuiveren
→ Concentrators
− Centrifugatie door filter volgens grootte
− Geen zout toevoeging
− Max capaciteit: te veel => verstopping
→ Speedvac
− Verdamping solvent
− Zouten/ onzuiverheden niet weg
RNA KWANTIFICEREN
→ Inschatting opbrengst
→ Te laag => onvoldoende input
→ Te hoog => inhibitie/ saturatie
Spectrofotometrie Absorptie licht door RNA (260nm)
Aspecifiek, overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
Wet Lambert-Beer => hoeveelheid RNA
Miniatuur = nanodrop
RNA > DNA absorberen
A260/280 < 2 => eiwitcontaminatie
A260/230 < 2 => zoutcontaminatie
Fluorimetrie Binding moleculen (ribogreen)
Selectief voor RNA, nauwkeurig, gevoelig
Omslachtig, licht/T-gevoelig
Lage concentraties
Elektroforese Scheiding RNA obv grootte
Concentratie, intactheid, lengte
(semi)kwantitatief
Agarose
→ Kan denaturerend
→ Totaal EU RNA = 28S en 18S bandje
→ gDNA contaminatie => hoog bandje
→ geen mRNA detecteren
Capillair
→ fluo kleurstof gebruiken
→ concentratie bepaling
→ RIN = 10 => volledig intact
→ RIN > 7 => NGS mogelijk
,RNA IN VITRO AANMAKEN
→ Bestuderen: RNA structuur/ eiwit-interacties
1) Chemisch = keten NTers maken => korte RNAs
2) Enymatisch = TXN
→ Polymerasen
− 5->3 elongatie
− Coderende streng = sense = positief
− Template streng = anti sense = negatief
− Uit bacteriofagen
→ DNA template
− Plasmide, PCR fragment, cDNA
− Terminatie = signaal/ einde fragment
− Initiatie: promotor/ in plasmide/ adaptor toegevoegd
RNA REVERSE TRANSCRIPTIE
→ In vivo: rerto virussen, telomerasen
In vitro: RNA -> cDNA => verder onderzoek
→ Buffer: DTT, RNAse inhibitor & ionen
geen herhaling van stappen!
Korte primer => lage T
1) Reverse transcriptase (uit virussen)
→ 5->3 DNA polymerase
→ RNAseH activiteit
− RNA-cDNA hybriden afbreken
− Bij aanmaak 2e streng nodig
− Beperkt lengte van cDNA
− RNAseH- voor lang cDNA
→ Te hoge T => denaturatie sec structuur, GC rijke template nodig
→ Geen amplificatie fouten
→ TdT activiteit => 3’ NT toevoegen (voor RNA seq)
2) Primers
→ Oligo dT
− Complement aan poly A staart
− Volledige lengte cDNA
− Enkel mRNA
− 3’bias > bij lang RNA/ sec structuur stopt TXN => minder 5’ eindes TXN
→ Random hexameren
− Efficiënt, voor al het RNA
− Gelijke vertegenwoordiging alle fragmenten
− Geen volledige lengte cDNA
, → Gen specifiek
− Moeilijk toepasbaar voor genen tegelijk
− Moeilijk voor weinig abundante genen
− Combinatie met qPCR
→ Bijzondere toepassingen
− Combinatie primers
− miRNA TXN
3) cDNA kloneren
→ expressievectoren maken
→ cDNA bib maken
→ dubbelstrengs cDNA nodig: RT (+PCR)
Blunt end
Niet directioneel oligo dT primer
Directioneel extra sequentie toevoegen
-> restrictie site
-> homologe recombinatie site
-> promotor voor TXN
Blauw = adaptor
Groen = primer
Ligatie onafhankelijk geen RE en ligatie
Niet directioneel TdT => C aan 3’ toevoegen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller JenteDG. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.42. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
50843 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now