Class notes
Hoorcollege CW
- Course
- Institution
Alle hoorcolleges samengevat van cel tot weefsel
[Show more]
Seller
Follow
lonnekespek
Reviews received
Content preview
HC1 Introductie en microscopieHoe groot zijn moleculen
- Transport vesicle is 100 nm
- Eicel is 0,2 mm
- Ribosomen zijn gemiddeld 20 nm
- Moleculen wordt ook eiwitten mee bedoeld
Microscopie
- Vergroting, contrast(verschil in kleur of grijswaarden), resolutie(kortste afstand tussen
2 onafhankelijke objecten die nog als 2 onafhankelijke objecten kan zien)
- Lichtmiscroscoop (resolutie 200nm, dus als ze minder dan 200nm van elkaar liggen
kan je ze niet apart van elkaar zien)
- Resolutie is beperkt door golflengte. Resolutie kan nooit meer worden dan de
helft van de golflengte. Hogere resolutie krijg je door hoger numerieke
apertuur van objectieve en condensor lenzen.
- Bright field
- Geavanceerde lichtmicroscopie
- Fluorescentiemicroscopie
- Elektronenmicroscopie (resolutie 1nm omdat de golflengte van elektronen veel
kleiner is dan van fotonen van licht)
- Resolutie is beter
- Scanning
- Transmissie
De lichtmicroscoop
- Lichtbron komt op object via lenzensysteem en spiegel. Object verstrooid het licht.
Dit verstrooide licht wordt via de lens op je oog geprojecteerd
- Resolutie tot 200nM
De fase-contrast microscoop
- Wordt gebruikt o.a. voor het bestuderen van levende ongekleurde cellen
- Extra ring geplaatst waar licht wordt tegengehouden.
- Achtergrond belichting wordt zo gescheiden van door het object verstrooide licht
Verhogen van contrast met kleuring bv. H&E kleuring
- Hematoxyline (blauw tot paars)
- Basische kleurstof: kleurt basofiele structuren
- Positief geladen
, - Bindt aan negatief geladen moleculen zoals DNA, RNA en
glycoproteïnen (met veel siaalzuur)
- Eosine (roze tot rood)
- Zure kleurstof: kleurt acidofiele structuren
- Negatief geladen
- Bindt aan positief geladen moleculen zoals de eiwitten in
bepaalde secretiegranula
Microscopie van weefsels: maken van coupes
- Isoleren: cultured cells(kunnen direct op microscoop slide net als dunne naald
aspiratiebiopt), biopt, scraping. Uitstrijkjes zijn cellen in vloeistof(structuur en
integriteit van weefsel niet meer te zien)
- Fixeren (bv. chemisch met een aldehyde of bevriezen) → cel gaat dood
- Inbedden in een matrix (in bv. gelatine of paraffine). Behoudt de structuur en
integriteit
- Coupes maken(sectioning) (5 um dik, paraffine met kamertemp. en bevroren bij -20
graden)
- Dan object op glaasje en dan kleuren voor contrast en labelen
- Dan vloeistof dat licht zo min mogelijk buigt met glaasje(coverslip) erop
- Interpretatie en archiveren
De plasmamembraan is 5nm dik, in lichtmicroscopisch dus alleen zichtbaar wanneer deze
schuin is aangesneden
Fluorescentie-microscopie: voor detectie specifieke moleculen
- Fluorofoor kan direct of indirect aan een specifiek molecuul worden gekoppeld
- Geschikt voor lokalisatie van die specifieke moleculen, ook in zeer kleine structuren
- Gelijktijdig gebruik meerdere fluoroforen mogelijk (dus ook verdeling van 2
verschillende eiwitten ten opzichte van elkaar)
- Toepasbaar zowel op gefixeerde als op levende cellen
De fluorescentie-microscoop
- Fluorescentie lamp, uv lamp of laser stuurt licht van 1 bepaalde golflengte door filter
en valt via spiegel door tweede filter op object
- 1ste filter laat alleen golflengtes door die de fluorescentie dye prikkelen. Filter 2 laat
alleen golflengte door die uitgezonden worden wanneer de dye fluoresceert.
- Als er fluorescente moleculen in het object zitten, dan resorberen die licht van een
bepaalde golflengte en kaatsen ze licht weg van een langere golflengte. Dat licht
gaat ook weer door filter en vang je op via oculair op je oog. Je ziet dan alleen de
structuren met de fluorescente moleculen en de achtergrond is zwart.
Productie van polyclonale antilichamen
1. Inject antigeen in konijn
2. Antigeen activeert B cellen
3. Plasma B cellen produceren polyclonale antilichamen
4. Obtain antiserum van konijn dat de polyclonale antilichamen bevat
5. Deze antilichamen kan je gebruiken voor het labelen van cellen
,Productie van monoklonale antilichamen
- 1 soort antigeen wordt door meerdere verschillende B cellen herkend en daardoor
worden verschillende soorten antilichamen gemaakt. Maar je wilt maar 1 soort.
1. Muis antigeen inspuiten
2. In milt worden B cellen gemaakt en vermenigvuldigd tegen het antigeen
3. Je pakt 1 soort B cel en die fuseer je met een myeloma cel(tumor cel onbeperkt
delen) → hybride cel
4. Nu krijg je dus een populatie cellen die 1 type antilichaam maakt
5. Dit is een monoclonal antilichamen. Deze koppel je met bv fluorescent dye.
6. Nu weer chemisch fixeren (koppelt alle eiwitten aan elkaar)
7. Weefsel inbedden en coupes maken (niet nodig voor losse cellen)
8. Cel lek maken(permeabiliseren), want nu is het plasmamembraan nog intact. Met
zeep(detergents) maak je de cel lek, waardoor antilichamen naar binnen kunnen
9. Immuno-labelen met antigen specifieke fluorescente antilichamen aan bv actine
10. Fluorescentiemicroscopie
- Labeling kan ook indirect: antilichaam die niet gelabeld is dus zonder fluorescent
bindt eerst. Dan een antilichaam met fluorescent bindt aan het antilichaam zonder
fluorescent. Het fluorescerende signaal kan geamplificeerd worden door meerdere
secundaire antilichamen te laten binden aan eerste antilichaam
- De sensitiviteit kan verhoogd worden door meerdere lagen antilichamen te
gebruiken.
Volgen van eiwitten in levende cellen
- Met fluorescente eiwitten, bv. Green Fluorescent Protein (GFP) → reporter gen
(codeert een eiwit dat makkelijk te monitoren is door zijn fluorescentie of
enzymatische activiteit)
- Die breng je tot expressie in de cel
- Het gen dat codeert voor GFP koppel je aan een gen voor eiwit bv actine→ hybride
gen. Dit zet je in een promotor en breng je de hybride gen in de cel → transfectie
- De cel gaat nu fluorescente actine produceren.
- Hierdoor kan je de actine delende cellen zien en hoe dit verandert onder de
fluorescentiemicroscoop. Dit heet fusion tag.
- Het heet pas reporter gen als gekeken wordt naar genexpressie. Als de gen aan
wordt gezet dan komt een fluorescent signaal tevoorschijn doordat de GFP is
gekoppeld.
- Je kan ook het gen van het eiwit gebruiken om het eiwit van de reporter gen te
maken waardoor de reporter eiwit op hetzelfde tijdstip, op dezelfde plaats en in
dezelfde hoeveelheid wordt gemaakt als dat het normale eiwit gemaakt zou worden.
Specifieke celtypen zichtbaar maken
- Kan dus met fluorescente eiwitten door genetische manipulatie
- Je kan bijv. gen voor zenuwcellen fluoresceren waardoor je in de ontwikkeling van de
embryo je die verandering ziet
- Wanneer iets licht(door fluorescentie) geeft kan je iets toch met lichtmicroscoop zien
ook al is het onderdeel kleiner dan 200 nm
Scanning elektronen-microscoop → detectie oppervlakte van structuur
- Je kan geen levende cellen zien met elektronenmicroscoop
, - Eerst chemisch fixeren
- Embedding: water wordt vervangen door plastic
- Geen coupes maken want je kijkt naar oppervlakte van structuur
- Opdampen met zwaar metaal → het kan elektronen verstrooien. Door lage-vacuum
sputter coating of hoge-vacuüm verdamping. Lood, uranium of osmium
- Door elektronenmicroscoop worden elektronen afgeschoten via elektromagnetische
lenzen gefocust zodat op elk punt van het object de elektronenstraal komt. Hierdoor
vindt er verstrooiing over het object plaats. Hoge-energie elektronen worden
verstrooid en lage-energie elektronen worden uitgezonden. Door een detector
worden de hoeveelheid verstrooide en uitgezonden elektronen gemeten, waardoor
een plaatje ontstaat op videoscherm. Videoscherm krijgt ook input van scanning
coils(magnetische lenzen)
- Tussen 3 en 20 nm
Transmissie elektronen-microscoop
- Chemisch fixeren met een aldehyde
- Inbedden in een matrix (bv plastic)
- Coupes (plakjes) maken (dunner dan bij licht microscopie), door mes gemonteerd op
ultramicrotoom
- Object wordt op rooster bedekt met koolstof gelegd
- Contrasteren met een oplossing van zwaar metaal zout (druppeltje van dit op het
object, OsO4 osmium bindt vooral aan lipiden, lood of uranium)
- Optioneel: immuno-labelen → goud bolletjes aan antilichamen en dit op het
object(daarna wassing waarbij niet-gebonden antilichamen worden verwijderd)
- Elektronenstraal wordt afgeschoten en gefocust door elektromagnetische lens.
Elektronenstraal komt op object die elektronen verstrooid. Ze worden nu niet
gebounced maar gaan er dwars doorheen. Vergroting gebeurt door
elektromagnetische objectieve lens en het elektronplaatje gaat nu door projector lens
op een fluorescent screen of direct recorded op camera. Plaatje kan bekeken worden
op scherm of film.
- Geeft informatie over de hele section
- Gaat tot 1nm
Verschil in licht en transmissie microscoop
- Bij licht zie je alleen een laag met kleur
- Met elektronen transmissie is de resolutie hoger waardoor je de structuur in die laag
kan zien
Detectie van een specifiek eiwit met elektronen-microscoop
- Fixeren
- Inbedden en dunne coupes maken (voor TEM)
- Immuno-labelen met specifieke antilichamen
- Labelen van 1e antilichaam met 2e antilichaam op colloidaal goud bolletje
- Contrasteren met zout van zwaar metaal
- TEM → hier zie je nu zwarte bolletjes (dit zijn de goud bolletjes aan het antilichaam
die gebonden is aan antigeen)
HC2 Introductie subcellulaire bouw
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lonnekespek. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.01. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67866 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now