Vraag 1:
We hebben verschillende methoden in de cursus besproken om het moleculaire gewicht van
macromoleculen te bepalen. Som ze op en leg kort voor elk van deze methoden het volgende uit:
1. Analytische centrifugatie
2. Gelfiltratie
3. [Massa spectrometrie (komt in deze cursus niet meer aan bod)]
- Hoe worden de macromoleculen in beweging gebracht teneinde het MW te bepalen?
1. Analytische centrifugatie: door een centrifugale kracht F= mω2r uit te oefenen op het
partikel.
2. Gelfiltratie: zwaartekracht laten werken op het solvent waarin het partikel is opgelost
(conventionele chromatografie) of pompen van het solvent (HPLC) of pompen onder
hoge druk (UPLC)
- Welk principe zorgt ervoor dat ze op basis van het MW gescheiden worden?
1. s = v/ω2r = M(1-V.ρ) / Nf
De sedimentatie coëfficiënt s of de lineaire snelheid van het partikel v doorheen het
solvent zijn recht evenredig met de molaire massa M
waarbij M = m.N
2. Afhankelijk van de poriëngrootte van de korrels zullen kleinere macromoleculen in de
korrels kunnen binnendringen en daardoor trager door de kolom lopen. De schijnbare
snelheid vx (dus ook retentietijd tR en retentievolume VR) is daarom evenredig met het
MW.
Vraag 2
Een analyte wordt over een ‘omgekeerde fase’ kolom van 15 cm lang gelopen aan een snelheid van
2cm/min. , en na 21 minuten elueert er een piek van 44 seconden breed (aan de basis). Bereken het
vertragingsvolume van deze stof. Is deze kolom goed genoeg om twee stoffen A en B met k A = 1,2 en
kB= 0,75 van elkaar te scheiden?
L = 15 cm, u = 2 cm/min., tR = 21 min. = 1260 sec., W=44sec.
R = ux/u = L/tR / u = 15cm/1260 sec. / 2cm/60 sec. = 900/2520 = 0,36
Bij scheiding moet de resolutie minstens 1 zijn. Deze wordt berekend als volgt:
N = 16 (tR/W)2 = 16 (1260/44)2 = 13.120
α = k2/k1 met k2 de hoogste k waarde, dus kA = k2.
α = 1,2/0,75 = 1,6
kav = 0,975
Rs = [1. (1,6-1) . 1,2 . √13120] / [4 . 1,6 . (1+0,975)] = 0,6 . 1,2 . ,4 . 1,975 = 82/12,64 = 6,48
prima scheiding dus!
Vraag 3
We hebben verschillende methoden in de cursus besproken om het moleculaire gewicht van
macromoleculen te bepalen. Som ze op en leg kort voor elk van deze methoden het volgende uit:
1. Analytische centrifugatie
2. Gelfiltratie
3. [Massa spectrometrie (komt in deze cursus niet meer aan bod)]
- Hoe worden de macromoleculen in beweging gebracht teneinde het MW te bepalen?
1. Analytische centrifugatie: door een centrifugale kracht F= mω2r uit te oefenen op het
partikel.
2. Gelfiltratie: zwaartekracht laten werken op het solvent waarin het partikel is opgelost
(conventionele chromatografie) of pompen van het solvent (HPLC) of pompen onder
hoge druk (UPLC)
- Welk principe zorgt ervoor dat ze op basis van het MW gescheiden worden?
1. s = v/ω2r = M(1-V.ρ) / Nf
De sedimentatie coëfficiënt s of de lineaire snelheid van het partikel v doorheen het
solvent zijn recht evenredig met de molaire massa M
waarbij M = m.N
2. Afhankelijk van de poriëngrootte van de korrels zullen kleinere macromoleculen in de
korrels kunnen binnendringen en daardoor trager door de kolom lopen. De schijnbare
snelheid vx (dus ook retentietijd tR en retentievolume VR) is daarom evenredig met het
MW.
Vraag 2
Een analyte wordt over een ‘omgekeerde fase’ kolom van 15 cm lang gelopen aan een snelheid van
2cm/min. , en na 21 minuten elueert er een piek van 44 seconden breed (aan de basis). Bereken het
vertragingsvolume van deze stof. Is deze kolom goed genoeg om twee stoffen A en B met k A = 1,2 en
kB= 0,75 van elkaar te scheiden?
L = 15 cm, u = 2 cm/min., tR = 21 min. = 1260 sec., W=44sec.
R = ux/u = L/tR / u = 15cm/1260 sec. / 2cm/60 sec. = 900/2520 = 0,36
Bij scheiding moet de resolutie minstens 1 zijn. Deze wordt berekend als volgt:
N = 16 (tR/W)2 = 16 (1260/44)2 = 13.120
α = k2/k1 met k2 de hoogste k waarde, dus kA = k2.
α = 1,2/0,75 = 1,6
kav = 0,975
Rs = [1. (1,6-1) . 1,2 . √13120] / [4 . 1,6 . (1+0,975)] = 0,6 . 1,2 . ,4 . 1,975 = 82/12,64 = 6,48
prima scheiding dus!
Vraag 3
