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Respiratorische Blutproteine
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Protokoll 17.11.2020 Despina Georgiadou Team 9Respiratorische Blutproteine
Einleitung:
Mit diesem Versuch werden Daten erhoben, mit denen der Einfluss von pH-Wert und
Temperatur auf die Sauerstoffbindungseigenschaften von Hummer Hämocyanin untersucht
werden kann.
Respiratorische Blutproteine sind Sauerstofftransportpigmente, die den nur geringfügig
gelösten Sauerstoff über große Entfernungen transportieren.
Am meisten verbreitet sind 3 Typen von Atmungspigmenten (Hämoglobin, Hämocyanin und
Hämerythrin), bei denen es sich durchweg um Proteide handelt. Deren prosthetische Gruppe
besitzt einen Metallatom-Kern, der für die Sauerstoffbindung verantwortlich ist.
Hämocyanin ist ein Blutfarbstoff der Arthropoden (z.B. Krebse, Spinnentiere, bei Insekten,
die Tracheen besitzen) und Mollusken (z.B. Muscheln, Schnecken und Tintenfische).
Im Gegensatz zu rotem, eisenhaltigem Hämoglobin wird der Sauerstoff in Hämocyanin durch
zwei Kupferionen gebunden. Darüber hinaus hat Hämocyanin keine Porphyrinstruktur wie
Hämoglobin. Stattdessen werden die Kupferionen über Aminosäurereste an das Protein
gebunden. Sauerstofffreies Hämocyanin ist farblos, mit gebundenem Sauerstoff ist es blau.
Die Sauerstoffbindung ist stärker als bei Hämoglobin. Im Vergleich zu Hämoglobin weist
Hämocyanin jedoch eine geringere Sauerstoffbindungskapazität auf, was zu einer insgesamt
geringeren Transportkapazität für Sauerstoff führt.
Gemessen wird hierbei mithilfe eines Photometers die Extinktion bei 340 nm bei
verschiedenen Sauerstoff-partialdrucken. Die Hämocyanin-Lösung wird mit Puffer auf eine
OD340 von 0,4 verdünnt. Dann werden die Proben mit Gasgemischen abnehmenden
Sauerstoffgehalts (von 20% bis 0%) begast und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm
verfolgt. Mit diesen Werten werden die Sauerstoffbindungskurven des sauerstoffgelandenes
Hämocyanins anhand der Sauerstoffsättingung und der O2-Partialdruck bei verschiedenen
pH und Temperaturen erstellt (davon werden die p50-Werte für die Sauerstoffaffinität
bestimmt). Danach werden die Daten umgerechnet, um ein Hill-Diagramm zu erstellen
(davon werden die Hill-Koeffizienten für die Kooperativität bestimmt).
Anschließend können die p50 Werte und Hill-Koeffizienten im Zusammenhang mit der
jeweiligen pH und Temperatur interpretiert werden.
Ergebnisse:
Daten bei pH=7,6 - 20 Grad
, Tabelle 1: Daten aus der Photometrie und für die Bindungskurve und das Hill-Diagramm bei pH 7,6 und 20 Grad
Berechnungsweise:
1- Korrigierung der Extinktion in Spalte B
Bei 0% liegt die gemessene Extinktion bei 0,049, was aber falsch ist. Das liegt daran, dass
im Absorptionsspektrum von Hämocyaninen eine andere Kurve bei 280nm erscheint,
was auf die Bindung der Kupferionen an das Protein über aromatische Aminosäurereste
zurückzuführen ist.
Deshalb müssen wir diesen Wert (in diesem Fall 0,049) von allen anderen abziehen.
z.B bei 20% Sauerstoff ist die gemessene OD340nm=0,436
Korrigiert ist OD34nm=0,436-0,049=0,387
2- Berechnung der Partialdrucke in Spalte D
Gesamtdruck=1020hPa
PO2= [(O2%)*(1020)] / 100
Z.B mit O2%=20%
PO2= (20% * 1020) / 100 = 204
3- Berechnung der % Sättigung in Spalte E
Die erste korrigierte Extinktion (mit O2%=20%) entspricht 100% Sättigung
Für den Wert OD340nm=0,372 gilt %Sättigung= [(0,372)*(100%)]/(0,387)=96,12%
4- Umrechnung für das Hill-Diagramm in Spalten F und G
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