Zusammenfassung Von der DNA zu Medikamenten: Bioinformatische Methoden in der Molekularbiologie
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Course
Bioinformatik und Biostatistik (BIOINFORMATIK)
Institution
Johannes-Gutenberg-Universität Mainz (JGU)
Inhalt von den ersten 4 Kurstagen von Bioinformatik:
DNA-Sequenzanalyse, Genfindung, Sequenzabgleich und Rekonstruktion des phylogenetischen Datenbankbaums
Übersetzung ohne Unterbrechung (zwischen Startkodons und Stoppkodons) = ‚offener Leserahmen‘ =
ORF
RNA-Viren (Unterschied CoV-HIV)
Coronaviren- RNA-Genom (27-32 Kb), umhüllt von Nukleokapsidprotein (was RNA stabilisiert, RNA liegt
nicht ‚nackt‘ im Virus), Lipidhülle mit 4 Proteinen, enthält + Sense Strang von RNA, Spike Protein für
Anheftung (Andockprotein)
-hat nur RNA Keine Transkription gebraucht, nur Translation: + Strang, ‚sense‘- Strang (weil es sich
direkt in Aminosäuren übersetzten lässt= macht Sinn)
Minus Strang (-- Strang) kommt bei Replication in der Zelle (wenn sich das Virus vermehren möchte) und
ist die Vorlage für viele + Stränge
-Wodurch unterscheiden sich Coronaviren ganz typisch von Retroviren wie z.B. HIV?
Coronaviren haben eine einzelsträngige RNA ohne Enzyme
HIV hat 2 einzelsträngige RNA (nicht komplementär, sondern gleich), wird in doppelsträngige DNA durch
DNA reverse Transkriptase (das Virus [im Viruskopf] besitzt die erste Moleküle der rev. Transkriptase)
umgewandelt und wird in Zellen gespeichert.
Zum Retrovirus, die RT ist teilweise mit in den viralen Partikeln, wird also mitgebracht
!!! Für Sequenzaufklärung im Labor wird RNA in DNA durch rev. Transcriptase (die aus Retroviren
stammen) umgeschrieben (RNA ist relativ anfällig und einfach zerbricht, nicht so stabil, deshalb ist DNA
besser für Sequenzaufklärung, auch DNA schneller und billiger)
Sanger-Prinzip
Das Sanger-Verfahren- Replikation (DNA Stränge werden verdoppelt) in vitro(=im Reagenzglass):
Zutaten: Matrize (einzelsträngig), Primer (synthetisch aus DNA anstatt RNA), DNA-Polymerase, dNTPs als
Bausteine
Wichtig!!! Der nobelüreiswürdige Trick:
Di-desoxynucleotide NTPs (ddNTPs) (Am 3‘C fehlt das OH und hat anstatt H, deshalb kann der Strang
nicht verlängert werdenTerminatoren) (anstatt nur Deoxynukleotide)
ddNTPs dNTPs (Deoxynucleotide, die normale)
,Die Mischung von ddNTPs und dNTPs macht es bei der Sequenzierung!
Grossensortierung in Gelelektrophorese- das erste Molekül ist das kleinste (wandert am schnellsten, geht
runter) (Farbintensitäten auch unterschiedlich) (Unterschied im Gewicht~ ein Nukleotid mehr in
Gelelektrophorese)
Auswertung von Sanger-Sequenzchromatogrammen von Plasmiden und PCR-Amplifikaten
Sequenzdaten-Chromatogramm (wird von links nach rechts gelesen): Polymerase hat ihr eigenes
Rhythmus, die Peaks werden nach unten unklar-nicht gut aufgelöst (denn- je länger die Nukleotide, desto
weniger der relative Unterschied)
Klausur 2020: 24.) Sequenzprimer wird nicht gefunden, woran liegt das?
Die Primer Sequenz kann man bei dem Chromatogramm nicht sehen- hat keine Abbruchstelle (κανένα
σημείο διακοπής) und kein Terminator! Nur die erste Stelle nach dem Primer kann man sehen
wird erst sichtbar
(Am Anfang- kaputte Moleküle laufen ganz weit unten und werden als erstes gezeigt)
!!! Welche Martizen-Moleküle können wir per Sanger-Technik sequenzieren?
1. Insert (Das Ziel ist, das Intergrat dieser Sequenz aufzuklären) und Vector. Primer kann (durch
Wasserstoffbrücken) auf den Vector gebunden werden (rechts (von oberen Strang) und links (von
unteren Strang)) –Primer ist einfach zu binden, weil Sequenz von Vector bekannt ist (links oder
rechts)
kein definiertes Ende, weil die Sequenz nach Insert zu schlecht wird und schneidet sich ab (im
Gegensatz zum 2.)
2. PCR Product (Moleküle in Mengen generieren)
2 Primer unbekannter Bereich sequenzieren obere Einzelstrang (P2 von rechts nach links
sequenzieren) oder untere Einzelstrang (P1 von links nach rechts sequenzieren)
hat ein definiertes Ende
Wir machen immer beides!
- Beide haben die Möglichkeit, von rechts oder von links anfangen zu sequenzieren
, Doppelsträngige Sequenzierung (Diagnostik) Schlüsseltechnik der Bioinformatik-
Sequenzvergleich durch Alignment
In PCR-Basen komplementär, Rückgrat ist anti-parallel Doppelsträngige Sequenzierung! Einmal von
links (forward read) und einmal von rechts (reverse read), wir können die Sequenzen miteinander
vergleichen und wir überprüfen damit, ob beide Sequenzen fehlerlos zueinander passen.
Schlüsseltechnik der Bioinformatik- Sequenzvergleich durch Alignment
‚Reverse Complement‘- Computer Alignment (aus Crick Strang ein virtuelles Watson Strang und checkt,
ob es übereinstimmt)
Q: Can you imagine the particular value of performing “double-stranded sequencing”, even if it doubles
the amount of work?
(Hilft Regionen mit schlechter Signalqualität abzudecken
Hilft, große Fehler in der Sequenzierungsregion zu identifizieren)
Shot-gun Genomsequenzierung
!!! Genom Sequenzierung: Die shotgun Strategie- zufälliges Zerbrechen der DNA—DNA Fragmente
(überlappen miteinander)
, Zufälliges Zerbrechen der DNA, sodass sich die DNA Fragmente miteinander überlappen. Wenn alle
Moleküle sequenziert werden, dann müssen die Buchstabe der Sequenz überlappen. Das heißt, dass sie
dann auf Ebene der Sequenz die Überlappung identifizieren und wenn man die Sequenzen
aneinanderhängt, kann man die sog. Konsensus-Sequenz (entspricht einem Chromosom).
Q : Hauptproblem bei Sequenzierung des menschlichen Genoms Repetitive DNA-Abschnitte und
Centromer + Telomerbereiche (weil sie auch repetitive DNA- Abschnitte haben)
Q: Why is this sequencing technique also known as “chain-termination sequencing”?
(chain-terminated by dideoxynucleotides) – 4 unterschiedliche Terminatoren werden verwendet- kommt
zur Abbruch (Elongation)- dadurch entstehen unterschiedlich lange Fragmente.
Q: Which chemical position of the nucleotide has to be modified to generate a “terminator” nucleotide
(ddNTP)?
Zuckermolekül 3’C
Klausurfrage 2020: 14.) Chemische Funktion des
Terminators bei der Sangersequenzierung (3‘-C
Desoxy)
DNA Polymerase braucht ein freies 3’OH, damit es weitere
Nukleotide einfugen kann. ddNTPs haben an dieser Stelle (3’C
Desoxy) H anstatt OH, deshalb kann die DNA Polymerase nicht
weitere Nukleotide einfügen
Q: What is the purpose of the primer in Sanger sequencing?
(Defines the sequenced region, Provision of a free 3‘-OH for
Elongation)
DNA Polymerase braucht ein freies 3’OH, damit es weitere Nukleotide einfugen kann. Das kommt vom
Primer. Es definiert auch die zu sequenzierende Region
Complete the sequence that will be generated starting from the following template DNA and primer:
5’ –CTAGTC- 3’ primer
3’ –GATCAGATATACCATG - 5’ template DNA
5’ –TATATGGTAC- 3’ sequence
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