Kurstag 1
Bio- [Genomforschung, Molekularbiologie, Biochemie, Physiologie]
-Informatik [Algorithmen, Datenbanken, Visualisierung, Simulation]
‘A deadly Virus’ Konzept:
-Labor: Isolierung der Erbsubstanz und Sequenzierung
Synonyme Substitution- eine Nukleotid Mutation, die keinen Unterschied in der Aminosäuresequenz
mit sich bringt (manchmal sind das stille Mutationen)
Nicht Synonyme Substitution, resultieren aus Punktmutationen. Das heißt, dass sich ein Nukleotid
ändert und daher wird die Aminosäuresequenz und auch das kodierende Protein geändert
Missense-Mutationen sind nicht-synonyme Substitutionen, die aus Punktmutationen resultieren,
Mutationen in einem einzelnen Nukleotid, die zur Substitution einer anderen Aminosäure und zu
einer Veränderung des kodierten Proteins führen.
Computer:
➔ Erkennen der Virusgene
➔ Ähnlichkeit zu bekannten Genen
➔ Phylogenetische Rekonstruktion
➔ Struktur der Proteine
➔ Wirkstoff-Design
-Labor: Wirkstoff-Test
DNA: auf Chromosomen aufgeteilt (in Chromosomen verpackt)
Sequenzierung ist Ablesen von DNA- Abfolge der 4 ‚Basen‘ enthält die Bauanleitung des Lebens
A und G (2 Ringe) T und C (1 Ring)
!!! Basen komplementär, antiparalell, immer von 5‘ Ende nach 3‘ Ende (immer von links nach rechts
lesen)
Watson (oben) oder Crick (unten) Strang
DNA- Informationsspeicher
RNA- Informationsabschrift
Protein- Product
!!! Wie erkenne ich ein proteinkodierendes Gen? → Diese Gene werden in einem Protein übersetzt
[Davor liest RNA Synthese die DNA] Startkodon ATG→ triplet Übersetzung →TAG STOP!
<< AUG → << →UAG STOP!
Übersetzung ohne Unterbrechung (zwischen Startkodons und Stoppkodons) = ‚offener Leserahmen‘
= ORF
[H2N-Aminosäuren-COOH (Protein)]
,Coronaviren- RNA-Genom (27-32 Kb), umhüllt von Nukleokapsidprotein (was RNA stabilisiert, RNA
liegt nicht ‚nackt‘ im Virus), Lipidhülle mit 4 Proteinen, enthält + Sense Strang von RNA
-Spike Protein für Anheftung (Andockprotein)
-hat nur RNA→ Keine Transkription gebraucht, nur Translation: + Strang, ‚sense‘- Strang (weil es sich
direkt in Aminosäuren übersetzten lässt= macht Sinn)
(Bild von Vorlesung)
Minus Strang (-- Strang) kommt bei Replication in der Zelle (wenn sich das Virus vermehren möchte)
und ist die Vorlage für viele + Stränge
[Genomic - RNA wird kopiert (+ RNA) um Vermehrt zu werden]
Zelluläre Andockstelle (Rezeptor) von SARS CoV-1 und -2 heißt ACE2
Covid-19 ist eine System Erkrankung! Nicht nur im Lungenweg! Überall können sie gehen.
CoV-2 10-15x effizienter als CoV-1 bindet
-Wodurch unterscheiden sich Coronaviren ganz typisch von Retroviren wie z.B. HIV?
Coronaviren haben eine einzelsträngige RNA ohne Enzyme
HIV hat 2 einzelsträngige RNA (nicht komplementär, sondern gleich), wird in doppelsträngige DNA
durch DNA reverse Transkriptase (das Virus [im Viruskopf] besitzt die erste Moleküle der rev.
Transkriptase) umgewandelt und wird in Zellen gespeichert.
!!! Für Sequenzaufklärung im Labor wird RNA in DNA durch rev. Transcriptase (die aus Retroviren
stammen) umgeschrieben (RNA ist relativ anfällig und einfach zerbricht, nicht so stabil, deshalb ist
DNA besser für Sequenzaufklärung, auch DNA schneller und billiger)
Methoden der DNA-Sequenzierung: chemische / enzymatische Sequenzierung (Sanger)
Das Sanger-Verfahren- Replikation (DNA Stränge werden verdoppelt) in vitro(=im Reagenzglass):
Zutaten: Matrize (einzelsträngig), Primer (synthetisch aus DNA anstatt RNA), DNA-Polymerase, dNTPs
als Bausteine
Wichtig!!! Der nobelüreiswürdige Trick:
,Di-desoxynucleotide NTPs (ddNTPs) (Am 3‘C fehlt das OH und hat anstatt H, deshalb kann der Strang
nicht verlängert werden→Terminatoren) (anstatt nur Deoxynukleotide)
ddNTPs dNTPs (Deoxynucleotide, die normale)
(Bilder von Vorlesung)
Die Mischung von ddNTPs und dNTPs macht es bei der Sequenzierung!
!!! Das Sanger-Verfahren
[DNA Matrize 3‘-Sequenz bekannt---unbekannt---5‘
5‘-(Primer, Bekannt) —DNA Synthese in unbekannten Bereich ---5‘
Ein T- Terminator muss eingebaut werden
(Durch Zufall erwischt die DNA Polymerase ein Terminator) (Κατά τύχη την πιάνει ένας τερματιστής)
Oder normaler T wird eingebaut und C-Terminator gebildet (und so weiter)
Immer ein Nukleotid länger und hat Terminator auf Nukleotid
Grossensortierung in Gelelektrophorese- das erste Molekül ist das kleinste (wandert am schnellsten,
geht runter) (Farbintensitäten auch unterschiedlich) (Unterschied im Gewicht~ ein Nukleotid mehr in
Gelelektrophorese)
Polymerase is elarmed (-θολωμενη) wird schwächer durch die Zeit
Je länger die Moleküle sind, desto weniger der relative Unterschied und desto schlechter kann das
Verfahren unterscheiden
Vor Gelelektrophorese: Denaturierung! Die bekannte Sequenz entfernen vor der Gelelektrophorese
Sequenzdaten-Chromatogramm (wird von links nach rechts gelesen): Polymerase hat ihr eigenes
Rhythmus, die Peaks werden nach unten unklar-nicht gut aufgelöst (denn- je länger die Nukleotide,
desto weniger der relative Unterschied)
Große Genome müssen in Schnipseln (reads) sequenziert werden und aus diesem Reads
bioinformatisch zusammengesetzt werden
Die Primer Sequenz kann man bei dem Chromatogramm nicht sehen- hat keine Abbruchstelle und
kein Terminator! Nur die erste Stelle nach dem Primer kann man sehen
wird erst sichtbar
(Bild von Vorlesung)
Am Anfang- kaputte Moleküle laufen ganz weit unten und werden als erstes gezeigt- unsere Aufgabe,
die Buchstabe von diesen zu löschen!
Auch am 3’Ende den unklaren Rest weglöschen
!!! Welche Martizen-Moleküle (Molekül-Formen) können wir per Sanger-Technik sequenzieren?
, 1. Insert (Das Ziel ist, das Intergrat dieser Sequenz aufzuklären) und Vector. Primer kann (durch
Wasserstoffbrücken) auf den Vector gebunden werden (rechts (von oberen Strang) und links
(von unteren Strang)) –Primer ist einfach zu binden, weil Sequenz von Vector bekannt ist
(links oder rechts)
kein definiertes Ende, weil die Sequenz nach Insert zu schlecht wird und schneidet sich ab (im
Gegensatz zum 2.)
(z.B. Insert stammt aus Eykaryoten - klonierte DNA)
(Bild von Vorlesung)
2. PCR Product (Moleküle in Mengen generieren)
2 Primer →unbekannter Bereich sequenzieren→ obere Einzelstrang (P2 von rechts nach
links sequenzieren) oder untere Einzelstrang (P1 von links nach rechts sequenzieren)
hat ein definiertes Ende
Wir machen immer beides!
- Beide haben die Möglichkeit, von rechts oder von links anfangen zu sequenzieren
(Bild von Vorlesung)
Sequenzvergleich duch Alignment- Schlüsseltechnik der Bioinformatik
Bio- [Genomforschung, Molekularbiologie, Biochemie, Physiologie]
-Informatik [Algorithmen, Datenbanken, Visualisierung, Simulation]
‘A deadly Virus’ Konzept:
-Labor: Isolierung der Erbsubstanz und Sequenzierung
Synonyme Substitution- eine Nukleotid Mutation, die keinen Unterschied in der Aminosäuresequenz
mit sich bringt (manchmal sind das stille Mutationen)
Nicht Synonyme Substitution, resultieren aus Punktmutationen. Das heißt, dass sich ein Nukleotid
ändert und daher wird die Aminosäuresequenz und auch das kodierende Protein geändert
Missense-Mutationen sind nicht-synonyme Substitutionen, die aus Punktmutationen resultieren,
Mutationen in einem einzelnen Nukleotid, die zur Substitution einer anderen Aminosäure und zu
einer Veränderung des kodierten Proteins führen.
Computer:
➔ Erkennen der Virusgene
➔ Ähnlichkeit zu bekannten Genen
➔ Phylogenetische Rekonstruktion
➔ Struktur der Proteine
➔ Wirkstoff-Design
-Labor: Wirkstoff-Test
DNA: auf Chromosomen aufgeteilt (in Chromosomen verpackt)
Sequenzierung ist Ablesen von DNA- Abfolge der 4 ‚Basen‘ enthält die Bauanleitung des Lebens
A und G (2 Ringe) T und C (1 Ring)
!!! Basen komplementär, antiparalell, immer von 5‘ Ende nach 3‘ Ende (immer von links nach rechts
lesen)
Watson (oben) oder Crick (unten) Strang
DNA- Informationsspeicher
RNA- Informationsabschrift
Protein- Product
!!! Wie erkenne ich ein proteinkodierendes Gen? → Diese Gene werden in einem Protein übersetzt
[Davor liest RNA Synthese die DNA] Startkodon ATG→ triplet Übersetzung →TAG STOP!
<< AUG → << →UAG STOP!
Übersetzung ohne Unterbrechung (zwischen Startkodons und Stoppkodons) = ‚offener Leserahmen‘
= ORF
[H2N-Aminosäuren-COOH (Protein)]
,Coronaviren- RNA-Genom (27-32 Kb), umhüllt von Nukleokapsidprotein (was RNA stabilisiert, RNA
liegt nicht ‚nackt‘ im Virus), Lipidhülle mit 4 Proteinen, enthält + Sense Strang von RNA
-Spike Protein für Anheftung (Andockprotein)
-hat nur RNA→ Keine Transkription gebraucht, nur Translation: + Strang, ‚sense‘- Strang (weil es sich
direkt in Aminosäuren übersetzten lässt= macht Sinn)
(Bild von Vorlesung)
Minus Strang (-- Strang) kommt bei Replication in der Zelle (wenn sich das Virus vermehren möchte)
und ist die Vorlage für viele + Stränge
[Genomic - RNA wird kopiert (+ RNA) um Vermehrt zu werden]
Zelluläre Andockstelle (Rezeptor) von SARS CoV-1 und -2 heißt ACE2
Covid-19 ist eine System Erkrankung! Nicht nur im Lungenweg! Überall können sie gehen.
CoV-2 10-15x effizienter als CoV-1 bindet
-Wodurch unterscheiden sich Coronaviren ganz typisch von Retroviren wie z.B. HIV?
Coronaviren haben eine einzelsträngige RNA ohne Enzyme
HIV hat 2 einzelsträngige RNA (nicht komplementär, sondern gleich), wird in doppelsträngige DNA
durch DNA reverse Transkriptase (das Virus [im Viruskopf] besitzt die erste Moleküle der rev.
Transkriptase) umgewandelt und wird in Zellen gespeichert.
!!! Für Sequenzaufklärung im Labor wird RNA in DNA durch rev. Transcriptase (die aus Retroviren
stammen) umgeschrieben (RNA ist relativ anfällig und einfach zerbricht, nicht so stabil, deshalb ist
DNA besser für Sequenzaufklärung, auch DNA schneller und billiger)
Methoden der DNA-Sequenzierung: chemische / enzymatische Sequenzierung (Sanger)
Das Sanger-Verfahren- Replikation (DNA Stränge werden verdoppelt) in vitro(=im Reagenzglass):
Zutaten: Matrize (einzelsträngig), Primer (synthetisch aus DNA anstatt RNA), DNA-Polymerase, dNTPs
als Bausteine
Wichtig!!! Der nobelüreiswürdige Trick:
,Di-desoxynucleotide NTPs (ddNTPs) (Am 3‘C fehlt das OH und hat anstatt H, deshalb kann der Strang
nicht verlängert werden→Terminatoren) (anstatt nur Deoxynukleotide)
ddNTPs dNTPs (Deoxynucleotide, die normale)
(Bilder von Vorlesung)
Die Mischung von ddNTPs und dNTPs macht es bei der Sequenzierung!
!!! Das Sanger-Verfahren
[DNA Matrize 3‘-Sequenz bekannt---unbekannt---5‘
5‘-(Primer, Bekannt) —DNA Synthese in unbekannten Bereich ---5‘
Ein T- Terminator muss eingebaut werden
(Durch Zufall erwischt die DNA Polymerase ein Terminator) (Κατά τύχη την πιάνει ένας τερματιστής)
Oder normaler T wird eingebaut und C-Terminator gebildet (und so weiter)
Immer ein Nukleotid länger und hat Terminator auf Nukleotid
Grossensortierung in Gelelektrophorese- das erste Molekül ist das kleinste (wandert am schnellsten,
geht runter) (Farbintensitäten auch unterschiedlich) (Unterschied im Gewicht~ ein Nukleotid mehr in
Gelelektrophorese)
Polymerase is elarmed (-θολωμενη) wird schwächer durch die Zeit
Je länger die Moleküle sind, desto weniger der relative Unterschied und desto schlechter kann das
Verfahren unterscheiden
Vor Gelelektrophorese: Denaturierung! Die bekannte Sequenz entfernen vor der Gelelektrophorese
Sequenzdaten-Chromatogramm (wird von links nach rechts gelesen): Polymerase hat ihr eigenes
Rhythmus, die Peaks werden nach unten unklar-nicht gut aufgelöst (denn- je länger die Nukleotide,
desto weniger der relative Unterschied)
Große Genome müssen in Schnipseln (reads) sequenziert werden und aus diesem Reads
bioinformatisch zusammengesetzt werden
Die Primer Sequenz kann man bei dem Chromatogramm nicht sehen- hat keine Abbruchstelle und
kein Terminator! Nur die erste Stelle nach dem Primer kann man sehen
wird erst sichtbar
(Bild von Vorlesung)
Am Anfang- kaputte Moleküle laufen ganz weit unten und werden als erstes gezeigt- unsere Aufgabe,
die Buchstabe von diesen zu löschen!
Auch am 3’Ende den unklaren Rest weglöschen
!!! Welche Martizen-Moleküle (Molekül-Formen) können wir per Sanger-Technik sequenzieren?
, 1. Insert (Das Ziel ist, das Intergrat dieser Sequenz aufzuklären) und Vector. Primer kann (durch
Wasserstoffbrücken) auf den Vector gebunden werden (rechts (von oberen Strang) und links
(von unteren Strang)) –Primer ist einfach zu binden, weil Sequenz von Vector bekannt ist
(links oder rechts)
kein definiertes Ende, weil die Sequenz nach Insert zu schlecht wird und schneidet sich ab (im
Gegensatz zum 2.)
(z.B. Insert stammt aus Eykaryoten - klonierte DNA)
(Bild von Vorlesung)
2. PCR Product (Moleküle in Mengen generieren)
2 Primer →unbekannter Bereich sequenzieren→ obere Einzelstrang (P2 von rechts nach
links sequenzieren) oder untere Einzelstrang (P1 von links nach rechts sequenzieren)
hat ein definiertes Ende
Wir machen immer beides!
- Beide haben die Möglichkeit, von rechts oder von links anfangen zu sequenzieren
(Bild von Vorlesung)
Sequenzvergleich duch Alignment- Schlüsseltechnik der Bioinformatik
