Dit document is een complete en zeer uitgebreiden samenvatting van het van Van Cel tot Weefsel / CW. Zowel de hoorcolleges als de zelfstudies zijn volledig uitgewerkt. Het document bevat veel afbeeldingen die de tekst verduidelijken en er is gewerkt met kleurtjes, voor optimaal leerefficiëntie. Ik...
Hoorcollege en ZS 1
Microscopie
Er zijn twee basale typen microscopen: lichtmicroscopen en elektronenmicroscopen. Omdat
elektronen een kortere golflengte hebben dan fotonen in het licht, kan een ER veel meer detail zien.
Hoe groot zijn moleculen, organen en cellen?
• Cellen
- Hele grote cellen (eicellen) zijn net zichtbaar met het oog: 0,2 mm
- De meeste cellen ±20 μm
- Kleine cellen (B-cel / ery) zijn nog kleiner
• Organellen in de cellen
- Transportblaasje: kleinste organel 100 nm
- Lysosoom / mito 0,5 /1 μm
• Moleculen in organellen
- Grote eiwitten tientallen nm’s
- Kleine eiwitten sub-nm
• Atomen < 0,1 nm
Hoe kun je de structuren waarnemen?
▪ Blote oog: tot ongeveer 0,1mm
▪ Lichtmicroscoop tot 200 nm
▪ Elektronenmicroscoop 0,2 nm > < 200 nm
Belangrijke termen microscoop
Vergroten = klein beeld groter afbeelden
Contrast = verschil in kleur/ verschil in grijswaarde
Resolutie = afstand waarbij objecten nog als onafhankelijke objecten
kunt zien.
- Resolutie lichtmicroscoop: 200 nm (golflengte licht)
- Resolutie elektronenmicroscoop: 1 nm
De resolutie wordt beperkt door de golflengte. Bij een lichtmicroscoop gebruik je
licht met een golflengte > 400 nm. De resolutie is dan de helft: 200 nm. De golflengte
van de elektronen is kleiner, waardoor de resolutie van een elektronenmicroscoop beter is.
1
, Door MvdM
Lichtmicroscopie: Bright-field; fase-contrast en fluorescentie
Lichtmicroscopen hebben een resolutie tot 200 nm. De golflengte van licht zorgt hierbij voor de
limitatie
1. Bright-field lichtmicroscoop
Licht wordt vanuit een lichtbron via een lenzensysteem en
een spiegel geprojecteerd op een object. Het object
verstrooit het licht. Het verstrooide licht wordt
geprojecteerd op de lens, waardoor je nu iets kunt
waarnemen. Je kunt met de BFM de natuurlijke kleuren
of gekleurde structuren zien.
2. De fase-contrast microscoop
Levende cellen kunnen niet worden bekeken met de BLM.
De cellen hebben te weinig contrast. Met de fase-contrast
microscoop kunnen levende, ongekleurde cellen worden
bestudeerd. Door een extra ring wordt de
achtergrondbelichting gefiltreerd van het licht dat wordt
verstrooid door het object. Er is nu wel contrast, waardoor je levende cellen kunt waarnemen.
2
, Door MvdM
3. Fluorescentiemicroscoop
Een fluorescentiemicroscoop werkt in principe hetzelfde als een normale
lichtmicroscoop, maar nu moet het licht door twee filters heen.
▪ Met de fluorescentiemicroscoop kunnen specifieke moleculen worden gezien in
plaats van alle structuren die bij een bepaalde kleur aankleuren. Je maakt bepaalde
structuren (zoals actine- filamenten) fluorescent: alleen deze lichten op.
▪ Er kunnen meerdere fluoroforen tegelijkertijd worden gebruikt. Zo kun je de
verdeling van meerdere eiwitten in een cel met elkaar vergelijken
▪ Toepasbaar op gefixeerde en op levende cellen
▪ Golflengte in → golflengte met minder energie terug
Een UV-lamp/ laser zendt monochroom licht uit. Dit is licht met één bepaalde golflengte. Het
monochrome licht wordt door een filter gelaten en geprojecteerd op het object. De
fluorescente moleculen zullen het quantum/golflengte van het monochrome licht absorberen
en een quantum/andere golflengte met minder energie weer uitzenden. Die golflengte wordt
opgevangen en geprojecteerd op de lens. Je ziet dan alleen fluorescerende moleculen tegen
een achtergrond van niet-fluorescerende materiaal.
▪ Er is recentelijk een super-resolutie fluorescentiemicrscoop ontwikkelt die een beeld kan
maken met een resolutie tot 20 nm. Het werkt met twee laser-bundels.
Prepareren voor de lichtmicroscoop:
Weefsels zijn te dik om met een lichtmicroscoop te bekijken. Er moet eerst een plakje van gemaakt
worden:
1) Vrijmaken van stukje weefsel
2) Fixeren
Dit gebeurt meestal chemisch. Aldehyde wordt hier vaak voor gebruikt. Twee reactieve
groepen kunnen met elkaar reageren, waardoor alle eiwitten in een cel aan elkaar worden
gekoppeld. Nu blijven alle structuren op zijn plek. Het weefsel wordt hier vaak harder door,
maar het is te slap om te snijden. Fixatie kan ook plaatvinden door het weefsel te bevriezen.
3) Inbedden in een matrix
Om het weefsel hard genoeg te maken om het te snijden, moet het worden ingebed in een
matrix: gelatine of paraffine
4) Coupes maken
De plakjes zijn slechts enkele μm’s dik
5) Kleuren
6) Op een glaasje leggen
3
, Door MvdM
Celstructuren zichtbaar maken:
Ook met een gewone bright-field microscoop kunnen cellen worden waargenomen,
maar deze moeten dan wel eerst gekleurd zijn. Hiermee wordt het contrast
verhoogd. Eerst worden cellen gefixeerd, daarna gekleurd met bijvoorbeeld H&E
• Hematoxyline
➔ blauw tot paars
= Basische kleurstof: kleurt basofiele structuren
- Positief geladen
- Bindt aan negatief geladen moleculen: DNA, RNA en glycoproteïnen
• Eosine
➔ roze tot rood
= zure kleurstof: kleurt acidofiele structuren
- Negatief geladen
- Bindt aan positief geladen moleculen: eiwitten in bepaalde secretiegranula
Een andere manier om cel-componenten zichtbaar te maken is door gebruik te maken van de
brekingsindex. Kleine verschillen in de brekingsindex kunnen door bepaalde optische
technieken zichtbaar gemaakt worden.
Labelen met antilichamen
Vaak worden structuren gelabeld met antilichamen.
Antilichamen zijn eiwitten die aan een bijbehorend antigen binden. Antilichamen bestaan uit 2x een
heavy-chain en 2x een light-chain. Er zijn dus twee identieke antigeen-bindingsplekken. Elk
antilichaam heeft een eigen specifiek antigeen.
Antilichamen worden gemaakt door B-lymfocyten. Elke rustende B-cel
draagt een ander membraangebonden antilichaam. Dit antilichaam werkt
als een receptor van een specifiek antigeen. Na binding van een antigeen
aan dit antilichaam, gaat de B-cel delen en grote hoeveelheden
antilichamen produceren.
Een antigeen heeft wel meerdere ‘herkenningsplekken’. Dit heten
epitopen.
Antilichamen kunnen gebruikt worden als moleculair label.
Een fluorescent antilichaam wordt aan een antigeen gekoppeld en kan worden
waargenomen met een fluorescentiemicroscoop.
Een goud-gelabeld antilichaam (of zilver) koppelt aan een antigeen en wordt
waargenomen met een elektronenmicroscoop
Preparatie bij fluorescent antilichaam
I. Fixeren van weefsel of cellen
II. Weefsel inbedden en coupes maken (niet nodig voor losse cellen)
III. Permeabiliseren van membraan met detergents (zodat de antilichamen naar binnen
kunnen)
IV. Immuno-labelen met antigen-specifieke fluorescente-antilichamen
V. Fluorescentiemicroscoop’
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller MvdM1. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.89. You're not tied to anything after your purchase.
