Instrumentele Analyse 2: spectrofotometrie
Inhoud
Week 7: UV/VIS-Spectrofotometrie.......................................................................................................3
Principe...............................................................................................................................................3
Elektromagnetische straling:..........................................................................................................3
Absorptie van licht:.........................................................................................................................3
Absorptie en emissie......................................................................................................................4
Wet van Lambert-Beer...................................................................................................................4
Extinctiecurve.................................................................................................................................5
Zichtbaar licht.....................................................................................................................................5
Opbouw Spectrofotometer................................................................................................................6
Blokschema spectrofotometer.......................................................................................................6
Cuvetten.........................................................................................................................................6
Enkelstraalspectrofotometer..........................................................................................................7
Dubbelstraalspectrofotometer.......................................................................................................7
Meerkanaalsspectrofotometer.......................................................................................................7
Limitaties aan de wet van L-B.............................................................................................................8
Fundamentele tekortkomingen......................................................................................................8
Instrumentele tekortkomingen......................................................................................................8
Chemische tekortkomingen............................................................................................................9
Nauwkeurigheid.................................................................................................................................9
Systematische fouten.....................................................................................................................9
Toevallige meetfouten....................................................................................................................9
Onnauwkeurigheden in de kalibratielijn.......................................................................................10
Toepassingen....................................................................................................................................10
Week8: Fluorimetrie.............................................................................................................................11
Theorie.............................................................................................................................................11
Alledaagse toepassingen..............................................................................................................11
Terminologie.................................................................................................................................11
Fluorescentie van een atoom.......................................................................................................11
Fluorescentie van een molecule...................................................................................................11
Metingen..........................................................................................................................................12
Enkele fluorescentie moleculen....................................................................................................12
Indirecte fluorescente analyses....................................................................................................13
Absorptie en emissie....................................................................................................................13
, Fluorimetrie......................................................................................................................................13
Fluor. vs spectrof..........................................................................................................................13
Blokschema...................................................................................................................................13
Analytische werkwijze..................................................................................................................13
Quenchers....................................................................................................................................14
Vergelijking met UV/VIS-spectrofotometrie.................................................................................14
Toepassingen....................................................................................................................................14
Week8: Nefelometrie...........................................................................................................................14
Theorie.............................................................................................................................................14
Turbidimetrie vs. nefelometrie.........................................................................................................14
Turbidimetrie................................................................................................................................14
Nefelometrie................................................................................................................................15
Golflengtekeuze............................................................................................................................15
Vergelijking...................................................................................................................................15
Toepassingen....................................................................................................................................15
Industriële toepassingen..............................................................................................................15
Klinische toepassingen..................................................................................................................16
Week 9: AAS.........................................................................................................................................17
Theorie.............................................................................................................................................17
Blokschema...................................................................................................................................17
Atomaire absorptiespectrofotometrie.........................................................................................17
Monster........................................................................................................................................17
Opstelling..........................................................................................................................................17
Blokschema......................................................................................................................................18
Verstuiver.....................................................................................................................................18
Vlam..............................................................................................................................................18
Holle kathodelamp (HCL)..............................................................................................................18
Elektrodeloze ontladingslamp (EDL).............................................................................................18
Monochromator...........................................................................................................................18
Detector en signaalverwerking.....................................................................................................19
Metingen: ijklijn................................................................................................................................19
Interferenties....................................................................................................................................19
Matrixinterferentie (NS)...............................................................................................................20
Chemische interferentie (NS)........................................................................................................20
Ionisatie-interferentie (NS)...........................................................................................................20
Spectrale interferentie (SP)..........................................................................................................20
2
, Achtergrondabsorptie(SP)............................................................................................................20
Emissie-interferentie(SP)..............................................................................................................20
Toepassingen....................................................................................................................................20
Week 10: AES........................................................................................................................................21
Atomaire van Spectrofotometrie......................................................................................................21
Theorie.............................................................................................................................................21
Definitie........................................................................................................................................21
Atomaire emissiespectrofotometrie.............................................................................................21
Toestel..............................................................................................................................................22
Blokschema...................................................................................................................................22
Vlamemissie..................................................................................................................................22
Vlam..............................................................................................................................................23
Invloed temperatuur....................................................................................................................23
Kwantificatie.................................................................................................................................23
Interferenties....................................................................................................................................23
Matrix-, chemische en ionisatie-interferentie..............................................................................24
Zelfabsorptie.................................................................................................................................24
Achtergrondemissie......................................................................................................................24
Spectrale interferentie..................................................................................................................24
Toepassingen....................................................................................................................................24
Vergelijking AES met AAS.................................................................................................................24
Week 11: Zelfstudiepakket ICP-OES.....................................................................................................25
2
,Week 7: UV/VIS-Spectrofotometrie
Principe
Elektromagnetische straling:
Atomen en moleculen kunnen straling opnemen (absorptie) of uitzenden (emissie)
Elektromagnetische straling kan worden voorgesteld als een elektrisch en een magnetisch
veld die zich verspreidt doorheen de ruimte. => vacuüm= snelheid van het licht. λ*f=c; c=
30 000 000 m/s
Het elektromagnetisch spectrum is de rangschikking van golven met oplopende golflengte
en afnemende frequentie.
Energie ve foton: E= h*f; h= 6,626 * 10-34 J*s
Absorptie van licht:
Het proces waarbij atomen of moleculen in een transparant medium selectief bepaalde
frequenties van het elektromagnetische spectrum gaan verminderen.
Bezit elk deeltje heeft een bepaalde energetische grondtoestand.
Wanneer een foton zo'n deeltje nadert, kan het geabsorbeerd worden op voorwaarde dat de
energie van het foton exact overeenkomt met het energieverschil tussen de grondtoestand
van het deeltje en één van zijn hogere energietoestanden. Het deeltje bevindt zich dan in
de geëxciteerde toestand: M + h*f => M*
Na een zéér korte periode zal dit geëxciteerde deeltje relaxeren naar zijn originele toestand
waarbij de overtollige energie wordt overgedragen aan deeltjes met: M* => M + warmte.
Wanneer in oplossingen de absorptie van licht wordt gemeten of gekwantificeerd, spreken
we over spectrofotometrie.
Relaxatie kan zich ook voordoen als emissie van straling, al dan niet fluorescent of
fosforescent; ook deze straling kan gemeten en gekwantificeerd worden.
2
, Absorptie en emissie
Karakteristiek voor een welbepaalde stof
Op dit principe berust de kwalitatieve analyse. Hier ga je zien welke stof het licht gaat
absorberen. Daarenboven geldt dat de mate waarin straling geabsorbeerd (of geëmitteerd)
wordt afhankelijk is van het aantal deeltjes dat zich in aangeslagen toestand bevindt. Hierop
berust de kwantitatieve analyse. Hier ga je de extinctie meten.
Om de absorptie te bepalen, meet je eerst de intensiteit van het ongehinderde, invallende
licht. Dit licht gaat door de monsteroplossing. Dan meet je de intensiteit van het niet-
geabsorbeerde licht. De verhouding tussen deze twee noemen we de transmissie: T= I/I0
We werken meestal met Extinctie(E)= -log T. Het verband tussen E en conc. is wel rechtlijnig.
Deze hebben beide geen eenheid.
Emissie daarentegen wordt gemeten als stralingsintensiteit. In principe heeft intensiteit de
eenheid W/m2; in de praktijk wordt de intensiteit door het meetinstrument vaak omgezet tot
een eenvoudig, dimensieloos signaal.
Wet van Lambert-Beer
Bij zeer lage concentraties geldt: E= ɛ*l*C
Bovenstaande vergelijking toont dat de molaire extinctiecoëfficiënt ɛ kan worden bepaald
met behulp van een kalibratielijn. Hiervoor kunnen we een externe of interne
standaardmethode en standaardadditie methode gebruiken.
De extinctiecoëfficiënt is een constante waarde die kan worden opgezocht in de literatuur.
Wanneer de eenheid van de extinctiecoëfficiënt niet uitgedrukt wordt in L/(mol*cm), maar in
mL/(g*cm) of in mL/(ppm*cm), spreekt men over de specifieke extinctiecoëfficiënt. In de
farmaceutische wereld wordt ook gebruik gemaakt van de extinctie bij 1% en 1 cm. Dit is de
extinctie van een oplossing met een concentratie van 1 mv% bij een weglengte van 1 cm.
2
Inhoud
Week 7: UV/VIS-Spectrofotometrie.......................................................................................................3
Principe...............................................................................................................................................3
Elektromagnetische straling:..........................................................................................................3
Absorptie van licht:.........................................................................................................................3
Absorptie en emissie......................................................................................................................4
Wet van Lambert-Beer...................................................................................................................4
Extinctiecurve.................................................................................................................................5
Zichtbaar licht.....................................................................................................................................5
Opbouw Spectrofotometer................................................................................................................6
Blokschema spectrofotometer.......................................................................................................6
Cuvetten.........................................................................................................................................6
Enkelstraalspectrofotometer..........................................................................................................7
Dubbelstraalspectrofotometer.......................................................................................................7
Meerkanaalsspectrofotometer.......................................................................................................7
Limitaties aan de wet van L-B.............................................................................................................8
Fundamentele tekortkomingen......................................................................................................8
Instrumentele tekortkomingen......................................................................................................8
Chemische tekortkomingen............................................................................................................9
Nauwkeurigheid.................................................................................................................................9
Systematische fouten.....................................................................................................................9
Toevallige meetfouten....................................................................................................................9
Onnauwkeurigheden in de kalibratielijn.......................................................................................10
Toepassingen....................................................................................................................................10
Week8: Fluorimetrie.............................................................................................................................11
Theorie.............................................................................................................................................11
Alledaagse toepassingen..............................................................................................................11
Terminologie.................................................................................................................................11
Fluorescentie van een atoom.......................................................................................................11
Fluorescentie van een molecule...................................................................................................11
Metingen..........................................................................................................................................12
Enkele fluorescentie moleculen....................................................................................................12
Indirecte fluorescente analyses....................................................................................................13
Absorptie en emissie....................................................................................................................13
, Fluorimetrie......................................................................................................................................13
Fluor. vs spectrof..........................................................................................................................13
Blokschema...................................................................................................................................13
Analytische werkwijze..................................................................................................................13
Quenchers....................................................................................................................................14
Vergelijking met UV/VIS-spectrofotometrie.................................................................................14
Toepassingen....................................................................................................................................14
Week8: Nefelometrie...........................................................................................................................14
Theorie.............................................................................................................................................14
Turbidimetrie vs. nefelometrie.........................................................................................................14
Turbidimetrie................................................................................................................................14
Nefelometrie................................................................................................................................15
Golflengtekeuze............................................................................................................................15
Vergelijking...................................................................................................................................15
Toepassingen....................................................................................................................................15
Industriële toepassingen..............................................................................................................15
Klinische toepassingen..................................................................................................................16
Week 9: AAS.........................................................................................................................................17
Theorie.............................................................................................................................................17
Blokschema...................................................................................................................................17
Atomaire absorptiespectrofotometrie.........................................................................................17
Monster........................................................................................................................................17
Opstelling..........................................................................................................................................17
Blokschema......................................................................................................................................18
Verstuiver.....................................................................................................................................18
Vlam..............................................................................................................................................18
Holle kathodelamp (HCL)..............................................................................................................18
Elektrodeloze ontladingslamp (EDL).............................................................................................18
Monochromator...........................................................................................................................18
Detector en signaalverwerking.....................................................................................................19
Metingen: ijklijn................................................................................................................................19
Interferenties....................................................................................................................................19
Matrixinterferentie (NS)...............................................................................................................20
Chemische interferentie (NS)........................................................................................................20
Ionisatie-interferentie (NS)...........................................................................................................20
Spectrale interferentie (SP)..........................................................................................................20
2
, Achtergrondabsorptie(SP)............................................................................................................20
Emissie-interferentie(SP)..............................................................................................................20
Toepassingen....................................................................................................................................20
Week 10: AES........................................................................................................................................21
Atomaire van Spectrofotometrie......................................................................................................21
Theorie.............................................................................................................................................21
Definitie........................................................................................................................................21
Atomaire emissiespectrofotometrie.............................................................................................21
Toestel..............................................................................................................................................22
Blokschema...................................................................................................................................22
Vlamemissie..................................................................................................................................22
Vlam..............................................................................................................................................23
Invloed temperatuur....................................................................................................................23
Kwantificatie.................................................................................................................................23
Interferenties....................................................................................................................................23
Matrix-, chemische en ionisatie-interferentie..............................................................................24
Zelfabsorptie.................................................................................................................................24
Achtergrondemissie......................................................................................................................24
Spectrale interferentie..................................................................................................................24
Toepassingen....................................................................................................................................24
Vergelijking AES met AAS.................................................................................................................24
Week 11: Zelfstudiepakket ICP-OES.....................................................................................................25
2
,Week 7: UV/VIS-Spectrofotometrie
Principe
Elektromagnetische straling:
Atomen en moleculen kunnen straling opnemen (absorptie) of uitzenden (emissie)
Elektromagnetische straling kan worden voorgesteld als een elektrisch en een magnetisch
veld die zich verspreidt doorheen de ruimte. => vacuüm= snelheid van het licht. λ*f=c; c=
30 000 000 m/s
Het elektromagnetisch spectrum is de rangschikking van golven met oplopende golflengte
en afnemende frequentie.
Energie ve foton: E= h*f; h= 6,626 * 10-34 J*s
Absorptie van licht:
Het proces waarbij atomen of moleculen in een transparant medium selectief bepaalde
frequenties van het elektromagnetische spectrum gaan verminderen.
Bezit elk deeltje heeft een bepaalde energetische grondtoestand.
Wanneer een foton zo'n deeltje nadert, kan het geabsorbeerd worden op voorwaarde dat de
energie van het foton exact overeenkomt met het energieverschil tussen de grondtoestand
van het deeltje en één van zijn hogere energietoestanden. Het deeltje bevindt zich dan in
de geëxciteerde toestand: M + h*f => M*
Na een zéér korte periode zal dit geëxciteerde deeltje relaxeren naar zijn originele toestand
waarbij de overtollige energie wordt overgedragen aan deeltjes met: M* => M + warmte.
Wanneer in oplossingen de absorptie van licht wordt gemeten of gekwantificeerd, spreken
we over spectrofotometrie.
Relaxatie kan zich ook voordoen als emissie van straling, al dan niet fluorescent of
fosforescent; ook deze straling kan gemeten en gekwantificeerd worden.
2
, Absorptie en emissie
Karakteristiek voor een welbepaalde stof
Op dit principe berust de kwalitatieve analyse. Hier ga je zien welke stof het licht gaat
absorberen. Daarenboven geldt dat de mate waarin straling geabsorbeerd (of geëmitteerd)
wordt afhankelijk is van het aantal deeltjes dat zich in aangeslagen toestand bevindt. Hierop
berust de kwantitatieve analyse. Hier ga je de extinctie meten.
Om de absorptie te bepalen, meet je eerst de intensiteit van het ongehinderde, invallende
licht. Dit licht gaat door de monsteroplossing. Dan meet je de intensiteit van het niet-
geabsorbeerde licht. De verhouding tussen deze twee noemen we de transmissie: T= I/I0
We werken meestal met Extinctie(E)= -log T. Het verband tussen E en conc. is wel rechtlijnig.
Deze hebben beide geen eenheid.
Emissie daarentegen wordt gemeten als stralingsintensiteit. In principe heeft intensiteit de
eenheid W/m2; in de praktijk wordt de intensiteit door het meetinstrument vaak omgezet tot
een eenvoudig, dimensieloos signaal.
Wet van Lambert-Beer
Bij zeer lage concentraties geldt: E= ɛ*l*C
Bovenstaande vergelijking toont dat de molaire extinctiecoëfficiënt ɛ kan worden bepaald
met behulp van een kalibratielijn. Hiervoor kunnen we een externe of interne
standaardmethode en standaardadditie methode gebruiken.
De extinctiecoëfficiënt is een constante waarde die kan worden opgezocht in de literatuur.
Wanneer de eenheid van de extinctiecoëfficiënt niet uitgedrukt wordt in L/(mol*cm), maar in
mL/(g*cm) of in mL/(ppm*cm), spreekt men over de specifieke extinctiecoëfficiënt. In de
farmaceutische wereld wordt ook gebruik gemaakt van de extinctie bij 1% en 1 cm. Dit is de
extinctie van een oplossing met een concentratie van 1 mv% bij een weglengte van 1 cm.
2
