19 - 10 - 2021
De bepaling voor welk fluorescerend eiwit
het gen op het plasmide in de E. Coli
bacterien codeert en de eigenschappen
van dit eiwit.
L. Waldram 2729236, A. Bierman 2724499
BOUWSTENEN VAN HET LEVEN; GEZONDHEID EN LEVEN;
AANTAL WOORDEN: 3729
1
, 19 - 10 - 2021
Abstract
Door GFP te gebruiken als marker-eiwit kan de aanwezigheid van een ander eiwit met fluorescentie
in een organische structuur ontdekt worden. Gemuteerde allelen van GFP zijn YFP, CFP en mCherry.
Deze eiwitten worden gebruikt om chimerische fluorescerende eiwitten te construeren die tot
expressie gebracht kunnen worden in levende cellen, weefsels en organismen. In dit onderzoek is
onderzocht voor welk fluorescerend eiwit het gen op het plasmide in de gekregen bacteriën codeert
en wat de eigenschappen zijn van dit eiwit. De gekregen bacterie is E. coli, wat een plasmide bevat
dat codeert voor het nog onbekende eiwit. Om te kunnen bepalen om welk eiwit het gaat, is er op
DNA-niveau geanalyseerd door agarose gel-elektroforese. Op eiwit-niveau is de eiwitconcentratie
bepaald met de Bradford-methode, is een SDS-PAGE uitgevoerd en is het absorptie- en
fluorescentiespectrum gemeten. Uit de DNA-analyse bleek dat het onderzochte eiwit vier bandjes
heeft van respectievelijk 3000, 2000, 1000 en 500 bp. Door dit te vergelijken met de in ApE
gegenereerde bandpatronen kan geconcludeerd worden dat het om mCherry gaat. Uit de eiwit-
analyse bleek dat het eiwit een concentratie heeft van 4,38 mg/ml. Het molecuulgewicht is 50 kDa.
De piek in het absorptiespectrum zat bij 590 nm en zond licht uit met een golflengte van 620 nm, wat
volgens de literatuur overeenkomt met de eigenschappen van mCherry. Uit zowel de DNA- als de
eiwitanalyse is gebleken dat het onderzochte eiwit mCherry is. In een vervolgonderzoek zouden
embryo’s en foetussen tijdens de ontwikkeling bestudeerd kunnen worden.
Inle iding
Er zijn verschillende eiwitten die voor verschillende kleuren zorgen, zoals bijvoorbeeld het Green
Fluorescent Protein (GFP). De ontdekking van GFP in de jaren ‘60 stelde onderzoekers in de
mogelijkheid om moleculaire kloonmethoden toe te passen en luidde daarmee een nieuw tijdperk
voor de celbiologie in (1). Bij deze nieuwe methode wordt de fluorgroep gefuseerd met een breed
scala van eiwitten en enzymen, resulterend in de mogelijkheid om allerlei cellulaire processen in
levende systemen op een flagrante manier te kunnen volgen met behulp van optische microscopie
en gerelateerde methodologie (1). In 1961 isoleerden Osamu Shimomura en Frank Johnson, van de
Universiteit van Washington, voor het eerst een calciumafhankelijk bioluminescentie eiwit (1). Dit
eiwit werd geïsoleerd uit de Aequorea victoria-kwal en werd aequorin genoemd (1). Tijdens deze
isolatieprocedure werd er nog een fluorescerend eiwit waargenomen dat enigszins verschilde van
het eerdergenoemde aequorin als het gaat om de emitterende eigenschappen (1).
Dit tweede ontdekte eiwit heeft een speciale structuur en produceerde onder invloed van UV licht
juist groene fluorescentie in plaats van blauw, en kreeg gevolglijk de naam Green Fluorescent Protein
(GFP) (1). Dit eiwit is een oplosbaar monomeer en zendt licht uit bij een piekgolflengte van 508 nm
onder invloed van het UV licht (2). De fluorescentie van het eiwit wordt uitgezonden door een
intrinsieke chromofoor (2). Dit chromofoor komt voort uit de covalente modificatie van een drietal
aminozuren (2). De peptidestructuur bevat een triplet van aminozuren (serine-, tyrosine- en
glycineresiduen) (1). De peptide structuur van GFP is essentieel voor de ontwikkeling en
instandhouding van de fluorescentie (1). Deze specifieke combinatie van aminozuren wordt ook in de
natuur gevonden maar leidt dan over het algemeen niet tot fluorescentie (1). Het feit dat de locatie
van de triplet zich bevindt in het midden van de vatstructuur bestaand uit 11 bèta-sheets (β-barrel),
maakt dit fluorescerende eiwit uniek. Door de cyclisatie van deze drie aminozuren wordt er een extra
dubbele binding gevormd en dit zorgt ervoor dat er een zogenaamd “extended π-electron system”
(3). Het systeem is in staat om zichtbaar licht te absorberen en uit te zenden (3). Op het moment dat
2
De bepaling voor welk fluorescerend eiwit
het gen op het plasmide in de E. Coli
bacterien codeert en de eigenschappen
van dit eiwit.
L. Waldram 2729236, A. Bierman 2724499
BOUWSTENEN VAN HET LEVEN; GEZONDHEID EN LEVEN;
AANTAL WOORDEN: 3729
1
, 19 - 10 - 2021
Abstract
Door GFP te gebruiken als marker-eiwit kan de aanwezigheid van een ander eiwit met fluorescentie
in een organische structuur ontdekt worden. Gemuteerde allelen van GFP zijn YFP, CFP en mCherry.
Deze eiwitten worden gebruikt om chimerische fluorescerende eiwitten te construeren die tot
expressie gebracht kunnen worden in levende cellen, weefsels en organismen. In dit onderzoek is
onderzocht voor welk fluorescerend eiwit het gen op het plasmide in de gekregen bacteriën codeert
en wat de eigenschappen zijn van dit eiwit. De gekregen bacterie is E. coli, wat een plasmide bevat
dat codeert voor het nog onbekende eiwit. Om te kunnen bepalen om welk eiwit het gaat, is er op
DNA-niveau geanalyseerd door agarose gel-elektroforese. Op eiwit-niveau is de eiwitconcentratie
bepaald met de Bradford-methode, is een SDS-PAGE uitgevoerd en is het absorptie- en
fluorescentiespectrum gemeten. Uit de DNA-analyse bleek dat het onderzochte eiwit vier bandjes
heeft van respectievelijk 3000, 2000, 1000 en 500 bp. Door dit te vergelijken met de in ApE
gegenereerde bandpatronen kan geconcludeerd worden dat het om mCherry gaat. Uit de eiwit-
analyse bleek dat het eiwit een concentratie heeft van 4,38 mg/ml. Het molecuulgewicht is 50 kDa.
De piek in het absorptiespectrum zat bij 590 nm en zond licht uit met een golflengte van 620 nm, wat
volgens de literatuur overeenkomt met de eigenschappen van mCherry. Uit zowel de DNA- als de
eiwitanalyse is gebleken dat het onderzochte eiwit mCherry is. In een vervolgonderzoek zouden
embryo’s en foetussen tijdens de ontwikkeling bestudeerd kunnen worden.
Inle iding
Er zijn verschillende eiwitten die voor verschillende kleuren zorgen, zoals bijvoorbeeld het Green
Fluorescent Protein (GFP). De ontdekking van GFP in de jaren ‘60 stelde onderzoekers in de
mogelijkheid om moleculaire kloonmethoden toe te passen en luidde daarmee een nieuw tijdperk
voor de celbiologie in (1). Bij deze nieuwe methode wordt de fluorgroep gefuseerd met een breed
scala van eiwitten en enzymen, resulterend in de mogelijkheid om allerlei cellulaire processen in
levende systemen op een flagrante manier te kunnen volgen met behulp van optische microscopie
en gerelateerde methodologie (1). In 1961 isoleerden Osamu Shimomura en Frank Johnson, van de
Universiteit van Washington, voor het eerst een calciumafhankelijk bioluminescentie eiwit (1). Dit
eiwit werd geïsoleerd uit de Aequorea victoria-kwal en werd aequorin genoemd (1). Tijdens deze
isolatieprocedure werd er nog een fluorescerend eiwit waargenomen dat enigszins verschilde van
het eerdergenoemde aequorin als het gaat om de emitterende eigenschappen (1).
Dit tweede ontdekte eiwit heeft een speciale structuur en produceerde onder invloed van UV licht
juist groene fluorescentie in plaats van blauw, en kreeg gevolglijk de naam Green Fluorescent Protein
(GFP) (1). Dit eiwit is een oplosbaar monomeer en zendt licht uit bij een piekgolflengte van 508 nm
onder invloed van het UV licht (2). De fluorescentie van het eiwit wordt uitgezonden door een
intrinsieke chromofoor (2). Dit chromofoor komt voort uit de covalente modificatie van een drietal
aminozuren (2). De peptidestructuur bevat een triplet van aminozuren (serine-, tyrosine- en
glycineresiduen) (1). De peptide structuur van GFP is essentieel voor de ontwikkeling en
instandhouding van de fluorescentie (1). Deze specifieke combinatie van aminozuren wordt ook in de
natuur gevonden maar leidt dan over het algemeen niet tot fluorescentie (1). Het feit dat de locatie
van de triplet zich bevindt in het midden van de vatstructuur bestaand uit 11 bèta-sheets (β-barrel),
maakt dit fluorescerende eiwit uniek. Door de cyclisatie van deze drie aminozuren wordt er een extra
dubbele binding gevormd en dit zorgt ervoor dat er een zogenaamd “extended π-electron system”
(3). Het systeem is in staat om zichtbaar licht te absorberen en uit te zenden (3). Op het moment dat
2
