Summary
Samenvatting kloneren en eiwitexpressie
- Course
- Institution
Samenvatting omvat het gehele vak kloneren en eiwitexpressie
[Show more]
Seller
Follow
Sali2001
Content preview
Kloneren en eiwitexpressie SamenvattingWeek 1
Plasmide: een stukje extrachromosomaal DNA, het zit niet in het chromosomaal DNA
bijvoorbeeld van een bacterie. Het moet er in geplaatst worden. Het is dubbelstrengs en kan
zich onafhankelijk van het chromosomale DNA repliceren. Ze komen voornamelijk voor in
bacteriën, maar komen ook voor in eukaryoten of Archaea. Een plasmide wordt ook wel
vector of construct genoemd.
Pilus: buisje waarmee een plasmide wordt overgedragen naar een bacterie, die een stukje
extrachromosomaal DNA in zich opneemt en zo een nieuw eigenschap krijgt, waarmee die
kan overleven.
Origin of replication (ori): startpunt replicatie; plekjes in het chromosomaal DNA waarin
dubbelstrengs DNA geopend wordt, zodanig dat DNA polymerase kan binden en het DNA
kan verdubbelen. Je hebt minder actieve Origins of replications (deze kunnen 15 - 20
plasmiden kopiëren per cel) en actieve Origins of replications (500 - 600 plasmiden
kopiëren per cel).
Heel veel plasmiden in een cel betekent, veel van dat gen die gecodeerd zijn op dat
plasmide, waardoor als het gen wordt aangezet (geïnduceerd) er veel eiwit geproduceerd
wordt.
Promoter: bestaat uit de TATAbox en het startcodon, transcriptie wordt hier gestart. Het
maken van mRNA en daarmee het maken van eiwit. De promotor kan een gen aanzetten
om eiwit te gaan maken. In een plasmide zijn er meerdere promotors aanwezig, omdat elk
gen aangezet moet worden.
DNA —> mRNA = transcriptie
mRNA —> eiwit = translatie
Ampicilline: het is een antibiotica, dus het zorgt ervoor dat bacteriën er dood aan gaan.
Bijna alle antibiotica remmen eiwitsynthese en ribosomen. Bij ampicilline wordt bij
bacteriën de synthese van de celwand geremd. Dan heb je nog Tetracycline,
Chloramphenicol, Kanamycine/ Neomycine, Bleomycine en Hygromycine B. Ampicilline
resistance gene is een gen dat codeert voor Beta-lactamase.
Beta-lactamase: breekt de beta lactam ring van ampicilline af door middel van hydrolyse.
Dus de C — N binding breekt en daardoor krijg je dus C & HN. Als de cel, een bacterie het
plasmide (in dit geval pGLO) bezit kan deze Beta-lactamase maken, kan deze de ampicilline
afbreken en dus blijven overleven op een ampicilline plaat. Alle andere bacteriën die dit
gen niet hebben, gaan dood.
Multiple cloning site (MCS): hier zitten restrictie-sites die heel efficiënt werken en maar
één keer knippen in het hele plasmide. Gemaakt door laboratorium analisten, zodat je als je
gaat kloneren je makkelijk kunt kiezen welk restricitie enzym je gaat gebruiken.
1
,Verschillende type vectoren: plasmiden, cosmiden, YAC en BAC.
Plasmiden worden gebruikt voor DNA manipulatie tussen de 10 - 20 kb.
Cosmiden worden gebruikt voor genetische bibliotheek van ongeveer 44 kb.
YACs worden gebruikt voor genetische bibliotheek van ongeveer 500 kb.
BACs worden gebruikt voor genetische bibliotheek van ongeveer 200 kb.
*Genomische bibliotheken: verzameling van het totale genomische DNA van een enkel
organisme
Cosmiden: gemodificeerde plasmiden en kloonvectoren deze bevatten een cos-sequentie
van de Lambda-faag. Cosmiden kunnen worden gebruikt om genomische bibliotheken te
bouwen. Cosmiden kunnen net als plasmiden repliceren, mits ze een geschikte oorsprong
van replicatie (ori) hebben. Cosmiden bevatten vaak ook een gen voor selectie, zoals
antibioticaresistentie, zodat de getransformeerde cellen kunnen worden geïdentificeerd
door uitplaten op een medium dat het antibioticum bevat. De cellen die de cosmide niet
opnemen, zouden niet kunnen groeien. In tegenstelling tot plasmiden kunnen ze ook in
vitro worden verpakt in faagcapsiden, een stap die samenhangende uiteinden vereist, ook
bekend als cos-sites die onder andere worden gebruikt bij het klonen met een lambda-faag
als vector.
YAC: staat voor Yeast artificial chromosomes en zijn genetisch gemanipuleerde
chromosomen die zijn afgeleid van het DNA van de gist, Saccharomyces cerevisiae, dat
vervolgens wordt geligeerd in een bacterieel plasmide. Door grote DNA-fragmenten in te
voegen, van ongeveer 500 kb, kunnen de ingevoegde sequenties worden gekloond en fysiek
in kaart worden gebracht met behulp van een proces dat chromosoomwandeling wordt
genoemd. Vanwege stabiliteitsproblemen werden YAC's verlaten voor het gebruik van
Bacterial artificial chromosomes (BACs). De primaire componenten van een YAC zijn de
ARS, centromeer en telomeren van S. cerevisiae. Bovendien worden selecteerbare
markergenen, zoals antibioticaresistentie en een zichtbare marker, gebruikt om
getransformeerde gistcellen te selecteren. Zonder deze sequenties zal het chromosoom niet
stabiel zijn tijdens extracellulaire replicatie en zou het niet te onderscheiden zijn van
kolonies zonder de vector.
BAC: staat voor Bacterial artificial chromosomes en is een DNA-construct, gebaseerd op een
functioneel vruchtbaarheidsplasmide (of F-plasmide), dat wordt gebruikt voor het
transformeren en klonen in bacteriën, meestal E. coli. F-plasmiden spelen een cruciale rol
omdat ze partitiegenen bevatten die de gelijkmatige verdeling van plasmiden na bacteriële
celdeling bevorderen. BAC's worden vaak gebruikt om het genoom van organismen te
sequencen. Een kort stukje van het DNA van het organisme wordt geamplificeerd als een
insert in BAC's en vervolgens gesequenced. Ten slotte worden de delen waarvan de
sequentie is bepaald, opnieuw gerangschikt in silico, wat resulteert in de genomische
sequentie van het organisme. BAC's werden vervangen door snellere en minder
arbeidsintensieve sequencing-methoden, zoals sequencing van het hele genoom en nu meer
recentelijk next-gen sequencing.
Kloneren stappenplan: insert (stukje DNA of mRNA) plak je in een vector/ plasmide, die
met dezelfde restrictie sites zijn geknipt. Die ligeer je (maak je weer heel), dan
transformeer je het in een bacterië (zodat het op kan groeien; bijvoorbeeld E. coli) en
uiteindelijk selecteer je de kloon die je wilt hebben en maak je daar een reinstrijk van.
2
, Daarna valideer je de kloons, door bijvoorbeeld restrictie analyse, PCR, DNA sequencing,
Southern blot.
Sticky ends: scheef knippen bv. G^AATTC & CTTAA^G
Blunt end: recht knippen bv. CCC^GGG & GGG^CCC
Sticky ends zijn handiger om iets weer terug te plakken.
Week 2
Transformeren: plasmide in de cel krijgen, waardoor onder selectiedruk (amp + LB) ze
gaan groeien en veel van het plasmide kunnen gaan maken. Gastheercellen kunnen zijn:
bacteriën, gisten of hogere eukaryoten. het inbrengen van DNA in een gastheercel
Je hebt chemische transformatie, electroporatie, gene gun, bacteriofaag, agrobacterium
tumefaciens en lentivirale expressie.
E. coli: goedkoop en eenvoudig medium (waardoor het snel groeit), verdubbelingstijd 20 -
30 min. en kan eenvoudig het plasmide DNA vermenigvuldigen. Niet alleen kloneren, maar
ook eiwitproductie.
Chemische transformatie: bij E. coli maak je de cellen competent, bij hogere eukaryoten
kun je kleine vetdruppeltjes (lyposoompjes (wordt ook wel fugene/ PEI genoemd), waar
het DNA in zit) en die kun je in een eukaryote cel brengen.
Competent maken: DNA is hydrofiel; celmembraan is hydrofoob. Om een stukje DNA de cel
in te krijgen is lastig, daardoor mak je de celwand competent (verzwakken van). Door
gaten te maken in het celmembraan: resuspenderen van snel groeiende cellen in een
oplossing met hoge Ca2+ concentratie. Tricky procedure, want de bacteriën zijn half dood
(niet stabiel) dus er moet voorzichtig mee worden omgegaan. Deze cellen worden bewaard
bij -80 graden Celsius.
Stappen chemische transformatie: 1.) cellen mengsen met DNA; 2.) 1/2 uur op ijs; 3.) heat
shock 45 sec. - 1.30 min. op 42 graden Celsius om de poriën te open zodat het DNA naar
binnen kan, daarna meteen op ijs om de poriën weer te sluiten; 4.) LB 1 uur op 37 graden
Celsius (vertroetelen); 5.) afdraaien; 6.) uitplaten LB medium met en zonder ampicilline
(antibiotica).
Electroporatie: in een cuvetje zitten elektrodes de cellen en het DNA doe je daarbij, je geeft
in één keer een elektrische puls. Het membraan verzwakt en het DNA kan naar binnen. Bij
juiste spanning (en dus stroom) ontstaan kleine poriën en bij hoge plasmide concentraties
worden deze opgenomen door de cel.
Gene Gun: DNA wordt gecoat aan gouden of wolfraam bolletjes, deze bolletje worden de
cel ingeschoten met een soort gun. DNA in de cel kan worden gerepliceerd en
getranscribeerd (eiwit gemaakt van worden).
Bacteriofaag: lysogene route —> Lambda DNA wordt in genomisch DNA ingebouwd,
replicatie samen met celdeling. Lyisische route —> productie van grote hoeveelheden
bacteriofagen, gastheercellen barsten.
3
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller Sali2001. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.88. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
75632 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now