Summary
modulatie van genexpressie samenvatting
- Course
- Institution
Dit hoofdstuk gaat over de modulatie van genexpressie en hoe we dit kunnen doen met verschillende methoden
[Show more]
Seller
Follow
saravanhecke23
Reviews received
Content preview
METHODEN: MODULATIE VAN GENEXPRESSIEDoel : functie en rol van eiwitten in fysiologie en pathologie bestuderen. Doelwitten identificeren
voor ontwikkelen van medicatie die functie van genproducten moduleren.
Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie
Principe: gebasseerd op Watson-Crick base paring met mRNA sequentie. 2 verschillende
methodologiën: ASO of RNAi.
Antisense oligonucleotiden (ASO)
Kort (9-50nt) enkelstrengig DNA (ssDNA) gericht tegen mRNA van gen waarvan men expressie wil
downmoduleren. DNA/RNA duplex. Onderdrukking van geexpressie via 3 complementaire
mechanismen:
- Op niveau van pre-mRNA: gericht tegen splicing motieven, poly-adenylatie (poly-A staart)
signaal – als er geen ploy A staart is gaat het RNA gedegradeerd worden
- Op niveau van mature mRNA: RNAse-H-afhankelijke target mRNA degradatie en blokage van
riboom binding site, 5’ cap site en translatie initatie site.
Er zijn hier barrières van toepassing:
- Opname in de cel en weefseldistributie
o Chemische modificatie – meer lipide achtig worden → makkelijker in de cel
o Ploymere nanopartikels
o Lipiden
- Stabiliteit: afbraak door nucleases
o Chemische modificaties belangrijk voor de backbone stabiliteit, zo resistenter tegen
afbraak, modificaties zijn mogelijk op verschillende plaatsen
- Toxiciteit
RNA interference (RNAi)
RNA interferentie is het proces waarbij de expressie van een doelwitgen onderdrukt wordt door de
selectieve inactivatie van het mRNA door dsRNA. Het dsRNA wordt geprocessed tot ssRNA dat dan
dan baseparen kan vormen met het doelwit mRNA. Dit is een proces dat reeds natuurlijk voorkomt
in cellen.
siRNA (small interfering RNA): dsRNA molecule, 20-25nt, synthetisch aanmaken.
shRNA (short hairpin RNA): ssRNA sequentie met regio die via hybridisatie hairpin structuur vormt,
~80nt, worden intracellulair geprocessed tot siRNA.
Mechanisme van RNA interferentie
Ze worden aangemaakt in de kern en volgen een standaard structuur, uiteindelijk gaan ze naar het
cytoplasma als pre-miRNA. Deze RNAi gaat herkend worden door nucleasen dat een klein stukje
tRNA gaat brengen waardoor er een klein stukje dsRNA gemaakt wordt. dit wordt herkend door het
RISC complex (=soort RNAse). Ene deel van RISC complex gaat passieve streng afbreken en daardoor
is het complex verbonden met 2 stukken ssRNA, die voor een stuk complementair is met mRNA,
zodat op deze manier bepaalde transcriptie van bepaalde genen geblokkeerd kan worden.
1
,Het dubbelstrengig RNA kan naar binnen komen dit kan gedaan worden
door dicer als het heel lang is, niet nodig bij korte stukjes. 20 nucleotiden
gaan dan perfect kunnen matchen, dat de werking gaat triggeren van
Arnaud, zo kan RNA afbreken en niet tot translatie komen.
siRNA structure: 2 primer overhangs. Een guide strand en een passenger
strand. 5’ in het behin (eerste 8 nt zijn het belangrijkste = send region).
Men kan deze siRNAs laten maken door bedrijven. Door deze siRNAs binnen te brengen zorgt dit
voor knock down van RNA (hangt af van het eiwit). Als cellen gaan delen → gaan deze siRNA verdunt
worden → minder effect en dus niet echt KO meer, vandaar transiënt. Verschillende methoden.
Nadelen:
- Off target effecten door interactie met de natuurlijke miRNA pathways
- Immuun stimulatie als reactie op lang dsRNA of op delivery vehikel → algemene
onderdrukking van eiwitsynthese
- Stabiliteit: onderhevig aan afbraak door nucleasen
o Oplossing voor de stabiliteit: chemische modificaties:
o Experimentele controles en ‘good practices’ - door de off targets die je kan hebben
is het belangrijk dat de conc van RNA niet te hoog is en de resultaten nooit op 1
siRNA gebasseerd worden.
Data moet altijd vergeleken worden met een negatieve controle, off-target effecten
moeten geanalyseerd worden + de antivirale respons moet nagegaan worden.
Al deze dingen kunnen zorgen voor verkeerde conclusies tijdens experimenten, rekening mee
houden!!!
shRNA: gebasseerd op DNA plasmide. Geen modificaties van het siRNA mogelijk. Knockdown kan
stabiel bij ingreng van plasmide via transductie en integratie in genoom.
Gendisruptie, mutagenese en editing
Transposons
Transposons zijn mobiele elementen. Genetische elementen die zich kunnen verplaatsen binnen het
genoom. Transposons maken de helft van ons genoom. Ontdekt in maïs (zwart en geel, sommige
hebben vlekken). De transposons komen bijna in al de organismen voor.
Voorbeeld maïs: 1 maïs graan komt van 1 andere cel. Als deze geel is dan zou men veronderstellen
dat deze sowiso geel is maar dat is niet waar. Het zwart worden is een transposon en kan dus
overspringen. Hoe groter de vlek (zwart) hoe vroeger het transposon actief was in de ontwikkeling.
2 soorten transposons:
- Klasse 1: retrotransposons (geen we niet verder op in)
- Klasse 2: DNA transposons
Autonome en niet autonome transposons. De autonome is afhankelijk van de niet-autonome.
Er zijn 2 terminal inverted repeats: 2 delen aan het uiteinde die omgekeerd hetzelfde zijn =
autonoom.
Niet-autonoom kunnen zichzelf niet verplaatsen want ze hebben geen transposase. Ze hebben een
autonoom transposon nodig om te verplaatsen.
2
, DNA transposon knip en plak mechanisme
Het transposon wordt herkend door het transposase. Er is een 9 base herhaling
dat komt door de integratie van het transposon. Het maakt sticky ends. Het
transposon gaat zo in het DNA geïntegreerd worden. De repeat is voor elk
transposase verschillend.
Er zijn 2 belangrijke transposons die gebruikt worden bij zoogdieren. SB is er 1 die
random inserties en distributies gaat maken. het transposase kan binden en het
DNA eruit halen en ergens anders insteken.
Sleeping beauty (SB):
- Transposon systeem werkzaam in vertebraten op basis van gereactiveerde slapende DNA
transposons uit genoom van vissen
- Non-virale DNA transfer tool voor efficiënte transposon-gebasseerde stabiele integratie van
GOI in eukaryote genomen: ‘close-to-random’ insertie distributie
Piggy bac (PB):
- Transposon systeem werkzaam in vertebraten geïsoleerd uit de mot Trichoplusia ni
- Efficiënte integratie in TTAA sites in genoom
- Grotere cargo mogelijk dan SB
- Naadloze excissie mogelijk (‘footprint-free’)
Mutagene cassettes:
Deze transposons kunnen DNA weg halen en terug integreren. Voor genmodulatie. Mutagene
cassettes maken. Heel klein deel van het genoom is maar coderend. Coderende lengte van genen is
zo klein, er is een veel grotere kans om in een intron te zitten dan in een exon. Daarom is het
makkelijker om een gen gewoon down te reguleren.
Inverted repeats – splice acceptor en poly A staart, dan een fusie. Indien er geen acceptor is dan is er
een klein stukje RNA en geen expressie → zo kan je genen uitschakkelen.
Poly A transposons: genen die actief tot expressie komen: cassette met een
promotor met een splice donor gaat men activeren waardoor transcriptie
plaatsvindt. Splicing van actieve gen zodat GFP tot expressie gebracht
wordt en het transposon zo in een actief gen verwerkt kan worden.
In een niet actief gen of geen poly A gen, RNA dat afgescheven wordt, niet
gepoly adenileert waardoor deze niet tot expressie komt.
Oncogenen in de cassette: sterke virale promotor gevolgd door een splice
donor. Het transposon kan hier in 2 richtingen integeren. Het eerste exon
komt tot expressie maar door de sterke virale promotor gaat de rest na het
eerste exon meer tot expressie gebracht worden.
Toepassing: genoombrede screening naar tumor suppresor genen
- “inactieverende” transposons: poly A signaal geflankeerd door splice acceptoren
- Verschillende soorten tumoren, hoofdzakelijk B cel lymfoma
gene trap: uitschakelen van genen: tumor supressor genen gaan uitschakelen → grotere kans kanker
Kijken naar een transposon in een muis, en kijken naar de copiën die het maakt. 14 copiën van het
transposon op Chr13 van de muis. Men gaat de muizen kruisen (transposase tot ontwikkeling). Zo
hebben de nakomelingen zowel het transposase als de transposons.
3
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller saravanhecke23. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.75. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
52510 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now