In dit document zijn de lessen over het eerste deel van het moleculaire vak uitgewerkt. De lessen zijn in 2021 gegeven en de samenvatting is geschreven met de leerdoelen in het oog (ook in het document beschreven).
Les 1 & 2
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
- Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
- Herkent sense en anti-sense sequenties
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen
- Weet welke factoren van belang zijn bij het ontwerpen van primers/probes
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
- Begrijpt het principe van real time PCR
- Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Kan een keuze maken voor een geschikt target voor een specifieke diagnostische real
time PCR
- Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers
(m.b.v.bijv.Primer3)
- Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-
organismen (virussen, bacteriën)
- Kent de diverse typen controles en het gebruik er van (positieve, negatieve, interne
controles en endo-/exogenecontrole)
- Kan de detectiegrens, specificiteit en sensitiviteit berekenen
- Kan de data van een real time PCR reactie met gebruik van SYBR green en Taqman
probes te interpreteren
- Kan de uitkomst van een kwantitatieve PCR omrekenen naar de load van een
monster
Morfologie: hoe ziet bacterie onder microscoop uit
DNA
16s RNA
- Zit alleen in bacteriën
- Wordt gebruikt om bacteriën met elkaar te vergelijken (familie, geslacht ect.)
Gen
o Geconserveerde regio; bij elke soort zelfde, anders sterft soort uit
o Variabele regio; anders bij elke soort, kan soort aan herkent worden
Structuur DNA
o Dubbele helix met suikermolecuul, fosfaat groep en een
basen
o Waterstofbruggen verbinden baseparen
o Strengen tegenovergesteld & anti-parallel
,Basen
o Purine (A, G) bindt aan pyrimidine (T, C)
o Adenine bindt aan thymine met 2 waterstofbruggen
o Guanine bindt aan cytosine met 3 waterstofbruggen
PCR
Taq-DNA polymerase; snelle maar slordige polymerase, geen proofreading
- Handig bij herkenning virus
- Niet handig bij sequensing
Polymerase; twee strengen nodig om te binden
Primers
- 18-25 nucleotiden lang
- Hoog G-C gehalte (40-70%)
- Ongv. zelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing tussen primer zelf of tussen twee primers (
- (mag niet omklappen, of forward & reverse binden
- Aplicon 75-200 bp. Hoogste efficiëntie
- Smelttemperatuur tussen 50 & 65 graden
Smelttemperatuur (Tm)
o Waar helft van DNA enkelstrengs is en andere helft dubbelstrengs
o Annealing temperatuur; iets onder Tm
Keuze gen & alignment
Primer
- Mag niet 100% gebonden zijn
- Mag losse 5’ kant hebben
- MAG NIET losse 3’ kant hebben
, Real time PCR
Lab vereisten
- Voor PCR detectie specifieke sequenties
- Specifieke technische handelingen, regenta & personeel
- Minimaal 3 verschillende ruimtes
Ruimte 1; maken master mixen, boven druk
Ruimte 2; ‘vieze lab’,toevoeging DNA aan mix ect.
Ruimte 3; PCR lab
‘Ruimte 4’; Aflees ruimte/ elektroforese
Voordelen
- Snelle werking; cycling times </=1,5 uur
- Hoge sample throughput (ongv. 200 monsters/dag)
- Heel gevoelig, in theorie; 1 dubbel strand DNA nodig om aan te tonen
- Detecteert kleinere verschillen tussen samples
- Grote dynamische range (10-10^10 copies)
- Reproduceerbaar
- Laag contaminatie risico
- Flexibele proefopzet
- Multiplex mogelijk (niet goed)
Meerdere targets 1 PCR
Theorie PCR
- Product = 2^n cycli
- Amplificatie; exponentieel, toename; gelimiteerd
- Real-time PCR geeft mogelijkheid om exponentiële fase te zien
> Met Ct kan je hoeveelheid start materiaal berekenen
Ct-waarde
o Cyclusnummer waar signaal boven
vastgestelde drempelwaarde komt
Drie methoden om test te kwantificeren
- DNA-bindende stoffen (SYBR-green,
EvaGreen, LC Green)
- Hydrolyserende probes (TaqMan,
Beacons)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller momoya. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.87. You're not tied to anything after your purchase.
