Samenvatting (q)PCR
Dogma van moleculaire biologie: Staan stappen in, a.d.h.v. type nucleïnezuur soort detectiemethode kiezen.
(q)-PCR: kunnen nucleïne zuren detecteren, dus zowel DNA als RNA detecteren. Wordt vooral gebruikt om te
kijken naar de expressie van genen. Lang niet al het DNA wordt omgezet in RNA, eigenlijk alleen de genen op
het DNA. RNA codeert vervolgens voor bijbehorende eiwit. Meten eigenlijk het RNA als een maat voor het
eiwit, want eiwit voert de functie uit en RNA zelf doet niet zoveel. Echter zijn eiwitten lastig te meten, daarom
(q)PCR dat gaat veel sneller en er zit een directe correlatie tussen de hoeveelheid RNA en het eiwit.
RT-PCR: reverse transcriptase PCR, van RNA naar DNA.
PCR: kan verdeeld worden in: Nested PCR, Gradient PCR (niet 1 temperatuur maar een oplopende temperatuur
instellen), Touchdown PCR.
-----> alle PCR soorten zijn gebaseerd op zelfde principe, namelijk de cycli en de componenten:
- Componenten: DNA sample, primers, nucleotiden, taq polymerase (enzym) dus buffer nodig om
optimaal te werken, buffer & epjes.
- Cycli: Denaturatie 95 graden, waterstofbruggen worden verbroken. Annealing 55-65 graden, beetje
afkoelen en primers. Extension 72 graden.
Begin van PCR is dat je een stukje dubbelstrengs DNA hebt met specifieke regio die je wil vermeerderen. Stap 1
is verhitten/denaturatie stap bij 95°C waarbij DNA uit elkaar smelt en de waterstofbruggen tussen de DNA
strengen verbroken worden en ontstaan 2 stukjes enkelstrengs DNA. Tweede stap is om die stukjes
enkelstrengs DNA af te laten koelen en de primers te laten hybridiseren, dus laten hechten aan enkelstrengs
DNA dit gebeurt rond de 60°C (afhankelijk van primers). Derde stap is om de temperatuur te verhogen en er is
DNA polymerase (72°C is optimale temperatuur voor taq) & DNTP’s nodig om de primers te kunnen verlengen
en zo het specifieke stukje DNA te amplificeren/vermeerderen.
Dit tussen de 30 & 40 cycli herhalen, hierdoor van ene stukje DNA een paar miljoen gemaakt.
Niet alle stukken op het DNA worden mee omgezet naar RNA, de stukjes die wel worden omgezet naar RNA zijn
de genen. RNA doet niet zo veel, wordt eigenlijk alleen omgezet in het bijbehorende eiwit, eiwit voert
uiteindelijk de functie uit.
RT-PCR: reverse transcriptase PCR, bijzonder!
- Omgekeerde transcriptie, altijd de flow van informatie: DNA->RNA->Eiwit, maar nu omgekeerd. Dus
maakt van RNA weer cDNA (complementair DNA).
- Ontstaan door speciale enzymen die virale RNA naar cDNA omzetten, waardoor dit DNA in genoom
van de gastheercel kon worden ingebouwd en geamplificeerd.
- Enzymen zijn: RNA afhankelijke DNA polymerases, bij normale PCR is het DNA afhankelijke DNA
polymerase, goed uit elkaar halen!!
- Van die enzymen (reverse transcriptase) maken wij gebruik tijdens RT-PCR.
- Om PCR uit te voeren op RNA, moet RNA eerst altijd worden omgezet naar cDNA. RNA is namelijk heel
onstabiel molecuul dus wordt snel afgebroken en dit is op het lab niet handig.
- Willen we RNA meten, dan kunnen we eerst isoleren en dan omzetten naar cDNA met de reverse
transcriptase PCR.
- Input is GEEN DNA maar RNA template. Verder alle zelfde ingrediënten en de reverse transcriptase is
in dit geval polymerase.
Reverse transcriptase PCR werkt als volgt:
- Er zijn cellen/weefsels of iets waar je RNA uit wil isoleren.
- Eerst gaat RT-PCR van mRNA -> cDNA maken, na veel cycli veel cDNA vanuit maar klein beetje RNA.
- Speciale primers nodig. Bij gewone PCR ontwerp je primers op een specifiek stukje. Maar doel van RT-
PCR is om al het RNA dat geïsoleerd is om te zetten in cDNA, dus NIET een specifiek stukje waar
specifieke primers voor nodig zijn.
- RNA terug naar DNA gemaakt, dus reverse dus complementair DNA. cDNA kan PCR op worden gedaan
dus meet uiteindelijk DNA. Sequentie en hoeveelheid is hetzelfde als mRNA van sample, dus worden
termen cDNA en mRNA door elkaar gebruikt. cDNA staat gelijk aan mRNA en aan de genexpressie,
want dezelfde sequentie maar moleculen zijn absoluut niet hetzelfde.
,Onderscheid in primers voor RT-PCR:
- Oligo (dT) primer: d van aantal en t van nucleotide. Is een korte sequentie van aantal T’s achter elkaar.
Handig omdat mRNA als eigenschap heeft dat deze een poly A staart heeft na mRNA sequentie. Het
rijtje met T’s kan binden op poly A staart dus kan mRNA naar cDNA worden omgezet.
- Random primers: weergegeven al 6x een N, kan iedere base zijn (A, C, T, G). Zijn kort dus random
gemaakt en doordat ze kort zijn is de kans groot dat ze ergens op mRNA binden. Hoe langer primer is,
hoe specifieker primer ook is dus hoe kortere primer hoe meer random en dus minder specifiek want
kan overal op RNA/DNA binden. Voordeel is dat ze ook op het mRNA kunnen binden en niet alleen aan
poly A staart.
- Meestal een combinatie van bovenstaande primers, paar random primers en paar Oligo dT primers
waardoor je zeker weet dat alles wordt omgezet in cDNA.
- Gen specifieke primers: specifiek voor een stukje sequentie in het mRNA molecuul. Voor gewone RT-
PCR gebruik je deze eigenlijk niet, wel handig als je micro RNA wil detecteren. Dat zijn hele kleine
stukjes RNA, wat met name in forensische werkveld aan bod komt.
PCR: een kettingreactie.
- Kenmerk, begin amplificeert DNA nog niet echt hard. Elke cyclus verdubbelt het DNA en dat is een
EXPONENTIELE reactie van producten. Gebeurt in het epje.
- In epje zie je alleen de uiteindelijke ladder na 30/40 cycli, hier is een agarose gel voor nodig.
- Plateau fase, als de reactie ophoudt, hier meet je bij een “gewone” PCR.
- Agarose gel gebruiken om zichtbaar te maken. Ladder nodig met bandjes die specifieke grootte
hebben. Runnen op agarose gel en kleur toevoegen kan je het zichtbaar maken. Alleen zichtbaar
maken OF het specifieke DNA geamplificeerd is. Kan er NIET uit halen of er nou meer of minder DNA of
RNA aanwezig is.
- Ook wel klassieke PCR, of end-point PCR want de reactie loopt af omdat DNTP’s op raken en
polymerase afloopt.
- Wil je weten of er meer is in ene sample of andere sample? Dan geïnteresseerd in de boog voor
plateau (S), maar is lastig bij gewone PCR omdat je niet weet waar je moet stoppen.
- Schuine deel geeft info over
- 1, hoe snel reactie verloopt. 2, hoe efficiënt reactie was. 3, of DNA wel echt verdubbeld is.
- Dit lukt niet bij gewone PCR, dus qPCR.
- RT-PCR en Real-Time PCR ((q)PCR) is niet hetzelfde, RT is namelijk reverse.
qPCR: gebaseerd op hetzelfde principe en de ingrediënten zijn grotendeels hetzelfde, paar aanpassingen.
- Grootste aanpassing zit in buffer, moet iets aan de buffer worden toegevoegd waardoor PCR gemeten
kan worden.
- Meten (kwantitatief) met fluorescentie, dat kan je meten bij bepaalde golflengte.
- Hoef binnenkant PCR niet te kennen voor tentamen.
- Werken met fluorescent molecuul dat wordt toegevoegd aan de reactie, niet bij normale PCR.
- Vervelende eigenschap, wordt vaak real time PCR genoemd.
- Meet na iedere cyclus het fluorescente signaal, signaal stijgt want na iedere cycli meer DNA/kopieën.
Signaal vlakt na bepaalde tijd wel af, net als bij gewone PCR.
- Door signalen van alle samples kan een rechte lijn worden getrokken, en kijken bij welke cycli de lijn
sample kruist: CT-waarde (cyclus threshold waarde).
- Hoe meer cycli PCR nodig heeft, hoe minder DNA aanwezig is. Want stel begint met meer DNA, dat
vermeerdert sneller dan dat je 1 stukje DNA hebt, dat vermeerderd minder snel want heeft meerderde
cycli nodig om ook op een bepaalde waarde te komen.
CT-waarde: geeft aan hoe hoog het fluorescentie signaal bij een bepaalde cutoff waarde is (horizontale lijn).
Lagere CT-waarde -> dan is er dus meer DNA in sample dan bij een hogere CT-waarde.
Fluorescentie: Twee meest gebruikte fluorescerende stoffen:
- Door moleculen die DNA kan binden, SYBR Green.
- Door probes die kan binden aan DNA, zoals Taqman probe.
SYBR-Green: vloeistof die aan buffer wordt toegevoegd.
- Fluorescerende kleurstof met specifieke eigenschappen.
- Gebonden aan dubbelstrengs DNA? Dan fluorescerend signaal.
, - Niet gebonden aan DNA? Dan geen fluorescerend signaal.
- Bindt alleen aan dubbelstrengs DNA.
- Fluorescentie kan gemeten worden, meer fluorescerend signaal, dan meer dubbelstrengs DNA
waaraan SYBR Green kan binden.
Nadeel: SYBR-Green bindt aan AL het dubbelstrengs DNA, ongeacht de sequentie. Dus absoluut NIET specifiek
(voor product, onderscheid cDNA of gDNA).
Voordeel: het is makkelijk in gebruik, snel & goedkoop.
Taqman: werkt ook met fluorescerend signaal, dat meten we.
- Zit een probe in het midden, probe is een DNA sequentie die je moet ontwerpen. Is complementair
dus kan DNA eronder binden.
- Taqman probe leg je tussen primers in, tussen forward primer (boven naar rechts toe) en reverse
primer (onder naar links toe).
- Aan probe bindt een Fluorophore en Quencher. Fluorophore is hetgeen wat fluorescentie kan geven.
Quencher is een onderdrukker.
- Als probe gebonden is en primers zijn gebonden, dan worden de primers geamplificeerd. De nieuwe
streng DNA die gemaakt wordt gaat de probe vervangen. Als probe beetje afgebroken wordt dan laat
Fluorophore los, wanneer Fluorophore in de buurt van de onderdrukker is dan heeft die geen
fluorescerend signaal maar als die loslaat en de afstand groter wordt met Quencher, dan zal deze
fluorescerend signaal geven. Verlenging van primers gaat door dus uiteindelijk wordt hele probe
afgebroken.
- Hoe meer product gemaakt wordt, hoe hoger fluorescerend signaal wordt.
Nadeel: doordat het heel specifiek is en zelf ontworpen moet worden, wordt het duurder.
Voordeel: dat het heel specifiek is omdat het zelf ontworpen wordt. Daarnaast geen optimalisatie nodig dus
geen controle nodig of fluorescerende signaal wel echt van target DNA is, want is ontworpen dus specifiek.
SYBER-Green VS Taqman:
- SYBR Green binding is reversibel: bindt alleen aan dubbelstrengs DNA, echter bij PCR wordt DNA
enkelstrengs gemaakt en enkelstrengs DNA bindt geen SYBR Green.
-------------> Fluorescerend signaal zal hoog zijn, lager worden, hoog zijn, enz. is dus reversibel. Bij specifieke
golflengte, namelijk groene spectrum.
- Taqman is irreversibel: als eindresultaat is de probe weg en die wordt niet meer terug gemaakt. Voor
ieder PCR product is een nieuwe probe nodig. Fluorescerend signaal kan op verschillende delen van
spectrum worden ontworpen.
------------> Hierbij kan fluorescerend signaal op verschillende delen van spectrum, dus kan meerdere probes in
een reactie. Dus dan 3 verschillende genen in 1 reactie meten. Veel gebruikt in forensische werkveld, want
weinig sample aanwezig dus meeste er uit halen met zo weinig mogelijk materiaal.
Hoe controleren of SYBER-green wel specifiek is: door smeltcurve.
- Begint op lage temperatuur en verhoogt de temperatuur waardoor DNA uit elkaar smelt. Als dit uit
elkaar smelt neemt fluorescentie af want SYBR Green kan niet meer binden.
- Gaat door tot er een specifiek punt is in de grafiek waar 50% ss en 50% ds DNA is, dit punt meten.
- Integraal nemen waardoor figuur wordt uitgezet in parabool. Ziet product die eigen piek geeft waarbij
een eigen temperatuur hoort. Dus verschillende temperatuur voor verschillende geamplificeerde
stukjes van verschillende grootte. Hoe groter PCR product hoe hoger smelttemperatuur, want meer
warmte nodig om waterstofbruggen te verbreken.
- Eerst hoog fluorescerend signaal, als temperatuur toeneemt zal fluorescerend signaal afnemen.
- BELANGRIJKSTE IN PCR wat niet specifiek is: een eerdere piek voor de pieken van de samples bij een
lagere temperatuur. Dit zijn primer dimers, dus als primers aan elkaar gaan binden, wordt dan ook ds
DNA maar is relatief kort dus zal bij een lagere temperatuur te zien zijn.
- Als er aan de rechterkant bij een hogere temperatuur nog een piek/pieken is/zijn dat is er niet
specifieke amplificatie van product.
, Taq polymerase: thermostabiel taq polymerase.
- Voor PCR is het DNA afhankelijk DNA polymerase.
- Voor RT-PCR is het RNA afhankelijk DNA polymerase.
- Werkt bij 75-80°C, terug te zien in temperatuur bij extension fase.
Nadeel taq: geen proofreading activiteit.
Proofreading activiteit: eigen foutjes kunnen herstellen.
PCR met taq polymerase bouwt regelmatig per ongeluk een verkeerde nucleotide in, taq kan het niet
herstellen. Als je genexpressie meet dus hoeveelheden maakt het niet uit maar wanneer de sequentie van
belang is dan is het wel erg dus maakt het wel uit dus dan polymerase met proofreading activiteit nodig. Zijn
bepaalde polymerase die wel proofreading kunnen zoals Pfu DNA polymerase, zijn dus ook specifiek &
betrouwbaar. -> Nuclease: knippen in DNA, wordt gebruikt bij proofreading om foute nucleotide te verwijderen.
Primers: bij (q)PCR anders dan andere PCR, voornamelijk manier van ontwikkelen.
- Eukaryotische cellen kenmerken: intronen en exonen.
- Ontwerp is anders want primers voor (q)PCR worden ontworpen op RNA. In DNA zou het niet
uitmaken waar primer op ontworpen wordt want veranderd niet echter bij RNA maakt dit wel uit want
zit in pre mRNA nog intronen en exonen in.
- Dit RNA moet nog bewerkt worden waarbij intronen eruit gehaald worden, exonen blijven over voor
mRNA. Hier rekening mee houden bij ontwikkelen van primers op RNA, want stel primer midden in
intron dan zou primer nooit kunnen binden. Goed weten waar exonen en intronen zitten zodat je weet
waar primers op gemaakt kunnen worden.
RNA kan ook een splice variant maken; dus dat 1 primaire RNA transcript twee verschillende soorten mRNA
kan maken. Afhankelijk van de exonen die wel/niet worden meegenomen. Is erg functioneel want vanuit 1 stuk
gen kan 1 stuk pre mRNA gemaakt worden en twee stukken mRNA. Ook belangrijk bij ontwerp.
Daarnaast meenemen dat we verschil willen zien tussen genomisch DNA en mRNA, er is een kans dat je gDNA
meeneemt bij het isoleren van mRNA uit sample omdat alles door elkaar zit. gDNA kan geamplificeerd worden,
dus klein beetje contaminatie kan al zorgen dat resultaat anders wordt, ook rekening mee houden bij ontwerp
primers.
Exon/intron grens: dus na exon 1 naar exon 2 i.p.v. naar intron ertussen, hierdoor PCR specifieker maken en
voorkomen dat we iets meten wat we eigenlijk niet willen meten zoals gDNA.
qPCR protocol: lengte van product is vaak wat korter. Bij PCR moet het namelijk op gel, nu alleen maar
fluorescentie meten dus niet zo veel product nodig.
- PCR product van 80-200bp, heeft gevolgen voor protocol.
- Zo snel mogelijk meten en zo weinig mogelijk tijd, product lengte maakt niet uit dus passen protocol
aan naar productgrootte.
- Binnen protocol blijft denaturatie stap gelijk, temperatuur en tijd, 30-40 cycli. Maar nu niet veel tijd
nodig om te denatureren dus kan iets korter, de annealing stap en elongatie stap worden
samengevoegd, tot 1 minuut i.p.v. 2 minuten.
- Dus in qPCR smeltcurve toevoegen, echter alleen bij gebruik van SYBER-green.
Samengevat de qPCR:
- Kwantitatieve PCR: bepaalde hoeveelheid meten na bepaald aantal cycli d.m.v. fluorescentie.
- Gebruik maken van fluorescentie molecuul, kan op 2 manieren: Taq man of SYBR Green.
- Zijn primers nodig, hierbij goed opletten of er RNA gemeten wordt of DNA.
- Taq polymerase waarvan verschillende soorten zijn waarbij standaard taq polymerase prima is maar
deze maakt wel veel foutjes die niet hersteld worden. Als sequentie belangrijk is dan andere
polymerase die eigen foutjes wel kan herstellen waardoor meer betrouwbaar.
- Ook wel real time PCR, maar geen RT-PCR want dat is reverse transcriptase.
- Meet na iedere cycli de hoeveelheid fluorescentie, bepaalde plek in grafiek waar de lijn stijgt
(exponentieel) en hierin geïnteresseerd.
