Summary
Samenvatting Moleculaire Biologie (GoO53C)
- Course
- Institution
- Book
Samenvatting van de belangrijkste informatie uit de lessen van Moleculaire biologie.
[Show more]
Connected book
Book Title:
Author(s):
- Edition:
- ISBN:
- Edition:
More summaries for
-
Chapter 7 Operon and Chapter 8: Major Shift in Transcription
-
General Transcription Factors:
-
RNA Processing II: Capping and Polyadenylation
Seller
Follow
freyavandeneynde16
Reviews received
Content preview
H1: De moleculaire aard vangenen
Geschiedenis
1. 1869: MIESCHER isoleerde nuclei uit etter vond fosforbevattende substantie (nucleine)
2. Einde van 19e eeuw: DNA en RNA gescheiden van proteïnen
3. 1910 – 1930: LEVENE karakteriseerde compositie van DNA/RNA: fosfaat + (deoxy)ribose
suiker + 4 verschillende bases
Belang van basensequentie nog niet ingezien
PROTEINEN, NIET DNA IS HET GENETISCH MATERIAAL
Tetranucleotide hypothese: fosforgroepen aan elkaar ipv aan de suiker
4. 1928: GRIFFITH deed aan bacteriële transformatie transformatie van component van
heat-killed virulente strain naar non-virulente strain
5. 1944: AVERY, MACLEOD & MCCARTY vinden dat het getransformeerde materiaal DNA is
geen virulentie meer na behandeling met DNase
DNA, NIET PROTEINE IS HET GENETISCH MATERIAAL
6. 1952: HERSHEY & CHASE vinden dat bacteriofaaginfectie van DNA komt gelabeld S-eiwit
komt niet in cel voor, maar gelabeld P-DNA komt voor in cel
7. 1953: WATSON & CRICK vinden dubbele helixstructuur van DNA
Chemische natuur van nucleïnezuren
Nucleoside= base + suiker
Nucleotide= base + suiker + fosfaatgroepen
FRANKLIN vond helixstructuur van DNA door X-stralendiffractie data liet repetitieve
structuur zien
WATSON & CRICK stelden structuur voor als dubbele helix met suiker-fosfaatruggengraat
aan de buitenkant en de bases aan de binnenkant
Tussen G en C: 3 H-bruggen vormen major groove (grote afstand tussen suikers)
Tussen A en T: 2 H-bruggen vormen minor groove (kleine afstand tussen suikers)
A-helix B-helix Z-helix
Draait rechts Draait rechts Draait links
In dsRNA Meest voorkomend Komt zelden voor
DNA-RNA Chromatine Poly(dGdC)
Nucleinezuur triple-helix
RNA-molecule met complementariteit aan dubbele DNA-helix laten binden (plaats genoeg in
grote groeve) geen Watson-Crick, wel Hoogsteen-basepairing
Kan in parallele en anti-parallele richting
Rol in chromatine organisatie, DNA repair, transcriptie regulatie en RNA processing
G-quadruplex
Spontaan gevormd als veel guanine-residues op DNA naast elkaar gelegen zijn + DNA-
polymerase haalt 2 strengen uit elkaar polymerasen raken erdoor geblokkeerd
1
,EIGENSCHAPPEN IN DNA
G/C en A/T verhoudingen zijn specifiek per organisme grote G/C verhouding in
organismen die leven in thermofiele bronnen (steviger aan elkaar)
Hoog G/C gehalte hoge smelttemperatuur
Hoog G/C gehalte hoge densiteit ( DNA scheiding door CsCl2 densiteit gradient
centrifugatie)
DNA kan gedenatureerd worden door organische solventen (DMSO, formamide), chaotrope
agentia (ureum; neutraliseert H-bruggen), hoge pH (NaOH) en lage zoutconcentratie
(ladingen stoten elkaar af en DNA denatureert)
Polynucleotideketen hybridizatie: samenvoegen van ssDNA en RNA northern blotting, S1
mapping, microarrays, FISH
DNA-grootte meten door elektronenmicroscopie en gelelektroforese
C-waarde paradox: de genoomgrootte staat los van de complexiteit van individu
Agarose Polyacrylamide
Horizontaal Verticaal
Lage resolutie Hoge resolutie
Natief DNA (niet) denaturerend
100 - >50.000 bp 1-1000 bp
Kleine fragmenten migreren sneller dan grote fragmenten
DNA renaturation (annealing)
Afkoelen complementaire strengen vinden elkaar terug (traag) ritssluiting (snel)
DNA kleiner maken door shearing (door sonicatie) grotere kans dat fragmenten hun
complement terug vinden
Bij lage zoutconcentratie + bij 20-25 °C
DNA sequencing (Dideoxy chain-termination
sequencing, Sanger)
1. Templatematrijs ssDNA nodig bindt aan primer die complementair is aan template
2. 4 DNA-bouwstenen en DNA polymerase toevoegen aan staal
3. Radioactief gelabeld ddATP toevoegen (ken geen nieuwe fosfodiesterbinding vormen
ketenterminatie)
4. Overmaat aan nucleotiden aanwezig toevallig ddATP ingebouwd polymerase stopt
5. Bij andere strengen gebeurt stop later/vroeger collectie fragmenten van verschillende
grootte die eindigen op A
6. Herhalen met ddTTP, ddCTP en ddGTP
7. Elektroforese: fragmenten scheiden met hoge resolutie
8. Bandjes visualiseren met kleurstof
9. Sequentie aflezen van onder naar boven
NU: capillaire elektroforese (800-1200 basen)
H2: Mechanisme van transcriptie
bij bacteriën
1. RNA polymerase structuur
Ionenuitwisselingschromatografie
2
, DEAE-cellulose kolom gebruikt voor opzuivering RNA polymerase
Oplossing eiwitten over kolom gestroomd - partikels blijven hangen, + gaat erdoor
- partikels elueren door ionische sterkte te verhogen
Scheiden volgens grootte met SDS-PAGE
A. RNA polymerase structuur ( Burgess, Travers 1969)
IEX van E. coli RNA polymerase SDS-PAGE van A, B en C pieken
Sigma: specificiteitsfactor + core: katalytische activiteit
B. Transcripti e-(a)symmetrie testen ( Bautz 1969)
Core enzyme transcribes both DNA
strands
Without sigma subunit: core enzyme has
basic transcribing ability, lacks specificity
2. Promotoren
C. Nitrocellulose fi lter-binding assay
Nitrocellulose bindt aan eiwitten, niet
aan ds DNA
DNA radioactief merken
1. Gemerkt ds DNA verschijnt in filtraat
2. Proteinen blijven aan nitrocellulosemembraan hangen
3. RNApolymerase blijft aan DNA hangen verschijnt niet in filtraat
D. Binden van RNA polymerase aan promotor ( Hinkle & Chamberlin 1972)
In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme/core
Overschot ongemerkt T7-DNA toevoegen
Nitrocellulosefilter-binding assay na verschillende periodes
Holoenzyme bindt DNA sterk
Core enzyme bindt meer kortstondig
E. Temperatuur en RNA polymerase binding
In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme en incubatie bij verschillende T
RNA polymerase bindt minder aan DNA bij lagere T
Hogere T promoten RNAP binding (door gemakkelijker DNA smelten)
RNA POLYMERASE/ PROMOTOR BINDING
1. Promotor search: holoenzyme bindt DNA eerst zwak en diffundeert langs DNA
2. Closed promotor complex formation (RPc): complex bindt zwak aan promotor (dsDNA in
gesloten vorm) lage affiniteit DNA
3. Open promotor complex formation (RPO): holoenzyme smelt DNA bij openen promotor
(polymerase wordt sterk gebonden)
FOOTPRINTING
1. DNA-fragment labelen met radioactieve P-groep
3
, 2. RNA-polymerase toevoegen
3. DNase toevoegen + eiwit verwijderen + DNA denatureren
4. Electroforesefragmenten van verschillende grootte electroforese
5. Bandenvrije zone: beschermd door eiwit Sanger
CORE PROMOTER ELEMENTS
A. -10 box (Pribnow box): TAtAaT
B. -35 box: TTGACa
C. UP element: in rRNA stimuleert transcriptie 30x
Promoter down mutations= mutations that weaken promoter binding increased
deviation from consensus sequence
Promoter up mutations= mutations that strengthen promoter binding less deviation
3. Transcriptie initiatie
F. Transcripti e initi ati e ( Carpousis 1980)
In vitro transcriptie van lacUV5 promotor in aanwezigheid gelabeld ATP denaturerende
PAGE autoradiografie
Polymerase begint aan promotor en gaat proefdraaien: produceert abortieve
transcripten
STAPPEN IN TRANSCRIPTIE INITIATIE:
1. Vorming closed promotor complex (RPc): losse binding
2. Omzetting naar open promotor complex (RPO): hechte binding
3. Polymerisatie eerste nucleotiden polymerase aan promotor (abortieve transcriptie)
4. Promotor clearance: transcript wordt lang genoeg om stabiele hybride te vormen met
templaat
Wanneer komt sigma los van complex?
G. Sigma sti muleert transcripti e initi ati e ( Travers & Burgess 1969)
In vitro transcriptie van T4 DNA door RNA polymerase core
Verschillende hoeveelheden σ
σ stimuleert initiatie en elongatie?
Elongatie lijdt tot meer C incorporatie
Rifampicine blockeert initiatie, niet elongatie
H. Reuse of sigma ( Travers & Burgess 1969)
In vitro transcriptie van T4 DNA door holoenzyme bij lage ionische sterkte (geen RNAP
dissociatie)
+ core (van Rif-resistant RNAP), +/- rifampicin
σ kan gerecycleerd worden voor initiatie
rifampicine blokkeert initiatie door met core te interageren
THE σ CYCLE MODEL
tijdens initiatie: σ kan gerecycleerd worden (σ-cyclus) core-enzyme laat σ los: dan
geassocieerd met ander core-enzyme
1. Obligate release model: σ dissocieert bij promotor clearance
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller freyavandeneynde16. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.05. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
78252 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now