De samenvatting bevat uitwerkte lesstof aangevuld met informatie uit het boek. Ook zijn er een klein aantal voorbeeldvragen weergegeven om een indruk te krijgen over de tentamenvragen. De samenvatting bevat een inhoudsopgave, hierdoor is het makkelijk om te zien welke onderdelen worden behandeld.
Inhoudsopgave
Leerdoelen moleculaire diagnostiek.......................................................................................................3
Introductie..............................................................................................................................................3
Methoden en Technieken in de Diagnostiek......................................................................................3
Productie van antilichamen................................................................................................................4
Immunologische detectie methoden......................................................................................................5
Immunoblot (Westernblot)................................................................................................................5
Radio immuno assay (RIA, gelabeld Ag)..............................................................................................5
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)....................................................................................5
Chapter 3 Nucleic acid extraction methods............................................................................................5
DNA isolatie........................................................................................................................................6
RNA isolatie........................................................................................................................................6
Detectie van Nucleïnezuren................................................................................................................6
Technieken voor nucleïnezuur analyse...............................................................................................7
Chapter 7 Chromosomal structure and chromosomal mutations..........................................................7
Chromosomaal structuur en analyse..................................................................................................8
Chromosomale morfologie.................................................................................................................8
Detectie van genomische of chromosomale mutaties............................................................................9
Karyotyping (in metafase)..................................................................................................................9
Spectral karyotyping (SKY)................................................................................................................10
Comparative genomic hybridization (CGH).......................................................................................11
Chapter 5 Analysis and characterization of nucleic acids and proteins................................................12
Hybridisatie.......................................................................................................................................12
Detectie van hybridisatie..............................................................................................................13
Hybridisatiemethoden......................................................................................................................13
Dot blot/ macroarray....................................................................................................................13
Microarray....................................................................................................................................14
In situ hybridisatie (FISH)..................................................................................................................14
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)...........................................................................15
Southern blot hydridisatie................................................................................................................15
Bereiding van probes........................................................................................................................15
Gelabelde probes.............................................................................................................................15
, Detectie van probes: Amplificatie.....................................................................................................16
Labeling van compleet DNA..............................................................................................................17
Chapter 6 Nucleic acid amplification....................................................................................................17
Polymerase chain reaction (PCR)......................................................................................................17
Speciale PCR’s...................................................................................................................................18
RT-PCR..........................................................................................................................................18
Hot start PCR................................................................................................................................18
Touch down PCR...........................................................................................................................18
Time release PCR..........................................................................................................................18
Inverse PCR (reverse PCR).............................................................................................................18
Repeat PCR (DNA fingerprint).......................................................................................................18
AP-PCR..........................................................................................................................................18
Amplification Fragment Length Polymorphism (AFLP).................................................................19
Multiplex PCR...............................................................................................................................19
Transcription-based amplification systems (TMA)............................................................................19
Chapter 8 Gene mutations...................................................................................................................19
Hybridization-based methods...........................................................................................................19
Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)......................................................................19
Denaturing Gradient Gel Elektrophoresis (DGGE)........................................................................19
Melt-curve analysis (MCA)............................................................................................................19
Allel-specifieke oligomeer analyse (ASO)......................................................................................19
Amplification-based methods...........................................................................................................20
Sequence-specific primer PCR (SSP-PCR)......................................................................................20
Ligase Chain Reaction (LCR)..........................................................................................................20
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA).........................................................20
DNA Sequencing...............................................................................................................................20
Sanger sequencing........................................................................................................................20
Vragen en opdrachten..........................................................................................................................21
,Leerdoelen moleculaire diagnostiek
De technische kant van de diagnostiek. Het leren begrijpen van technieken, principes en detectie.
Introductie
Snelcursus Grieks en Latijn
Diagnostiek bestaat uit de woorden Dia-gnostiek, wat betekend: Er door weten/kennen. Grieks en
Latijn wordt veel gebruikt in de medische werkvlakken, daarom is het belangrijk om te weten wat
verschillende woorden en voorvoegsels betekenen.
Voorvoegsels
a niet (atypisch, anemie)
dia er door (diagnostiek, diafyse)
epi bovenop (epifyse, epigenetica)
neo nieuw (neoplasie
pro/pre voor en na (prognose, prenatie)
Terminologie Moleculaire Diagnostiek
Diagnostiek op basis van fysiologische kenmerken -> Koorts, bloeddruk, hartslag
Met behulp van moleculaire biomarkers -> verlaagd, verhoogd, veranderd
Moleculen worden onderzocht op basis van nucleïnezuur -> moleculair
Of op basis van eiwitten, suiker, vet, etc -> biochemisch
Biomarkers helpen bij het onderzoeken van de oorzaak van de ziekte en kenmerken geassocieerd
met ziekte
Methoden en Technieken in de Diagnostiek
Biospecifieke methoden:
- microscopische detectie door kleuring van weefselcomponenten
- chemische detectie door gebruik substraat en enzym
- immunologische detectie door reactie antigen en antilichaam
- moleculaire detectie op basis van nucleïnezuren hybrisatie (DNA/RNA)
Deze methoden worden vaak samen gebruikt. Een voorbeeld hiervan is bijvoorbeeld de diagnostiek
van diabetes mellitus.
Een ander voorbeeld is de bepaling van eiwitten. Door chemische detectie is de activiteit van
enzymen te meten. De afname van het substraat of de vorming van het product is een maat voor de
enzym activiteit. Door immunologische detectie is de hoeveelheid eiwitmoleculen te meten.
,Chemische detectie
Op basis van enzymactiviteit ontstaat er een meetbare
hoeveelheid substraat. Dit wordt gemeten door middel van
spectrofotometrie.
Immunologische detectie
Om een stof aan te tonen kunnen er antigenen en antilichamen gebruikt worden. Technieken die hier
onder vallen zijn Westernblot en ELISA. Deze technieken hebben een hoge specificiteit en kwaliteit.
Echter is het moeilijk om een kwantitatieve hoeveelheid te krijgen, is het erg arbeidsintensief en is
de gevoeligheid soms niet betrouwbaar genoeg.
Productie van antilichamen
Door antilichamen voor het enzym hexokinase te verkrijgen, wordt er hexokinase in een konijn
gespoten (in spierweefsel). Het konijn zal antilichamen aanmaken voor het hexokinase, deze worden
later geïsoleerd: er is een antiserum.
Polyclonaal en monoclonaal antiserum (1975 Köhler & Milstein)
Uit het antiserum van het konijn bevat meerdere typen antilichamen (een polyclonaal antiserum)
Daarom worden er vaker antisera gehaald uit een muis. Deze maken een enkel antilichaam aan, wat
een monoclonaal antiserum is.
Er worden nu vaak andere technieken gebruikt om antilichamen te werven. Dit door een plasma (b-
cel/lymfocyt) te isoleren. Deze cel is uit de milt te halen en wordt gefuseerd met een tumorcel. De
hybridoma cellen blijven het antilichaam voor een lange tijd produceren.
De hybridoma cellen worden gekweekt door in een 96 wells-plaat, 0,8 cel per well te pipetteren. Zo
kan er per cel gekeken worden of deze de antilichamen aanmaakt en deze kan dan weer gebruikt
worden om antilichamen te kweken.
Monoclonale antilichamen (MAb’s) worden toegepast in:
- diagnostiek
- fundamenteel onderzoek
- zuiveren van stoffen
- behandeling
Faag display
Bij de faag display zijn zelf de B-cellen niet meer nodig. Er worden een aantal cellen uit een
organisme geïsoleerd (organisme maakt niet uit, wangslijmvlies is het makkelijkste). Alle cellen
bevatten het complete DNA, oftewel DNA bibliotheek. Het DNA wordt geknipt in stukjes, de nodige
sequentie wordt hier uit gehaald en wordt geplaatst in het plasmide van een bacterie. Dit is vaak
E.coli. De bacteriën kunnen het eiwit maken waar het nieuwe stuk DNA voor codeert.
,Fragmenten
Een antilichaam is een Y-vormig eiwit bestaande uit polypeptide ketens. Er zijn twee identieke zware
en lichte ketens, deze zijn gebonden door disulfide. En de antilichamen zijn redelijk stabiel. Bij
fragmenteren wordt het variabele gedeelte van het antilichaam veranderd. Hierdoor zijn er
specifieke antilichamen te kweken.
Immunologische detectie methoden
Immunoblot (Westernblot)
Scheiding van eiwitten met gel electroforese over SDS page gel waarna de eiwitten op een PVDF
membraan worden getransfered. Het target eiwit wordt aangetoond met primair, specifiek
antilichaam. De detectie vaak met secundair, gelabeld, anti-species antilichaam.
Agglutinatie (inhibitie)
Radio immuno assay (RIA, gelabeld Ag)
Een zeer gevoelige techniek voor detectie van antigenen met een lage concentratie (bijvoorbeeld
hormonen). Het patiënt antigen wordt gemengd met vaste hoeveelheid radioactief antigen. Er is
competitie om de bindingsplaatsen op het antilichaam. Dus hoe meer hormonen, hoe minder signaal.
Enzyme immuno assay (EIA, enzym labeling)
Immunoradiometric assay (IRMA, gelabeld Ab)
Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA)
Binding van antilichaam aan target (antigen). Het
gebonden antilichaam wordt aangetoond met
geconjugeerd (covalent gebonden) enzym. Er
vormt een gekleurd (oplosbaar) product.
Extractie van nucleïnezuren uit cellen
1. Lysis van cellen (en kernen)
2. Opzuivering van de nucleïnezuren
3. Bepaling van concentratie en zuiverheid
Verwijderen van eiwitten
- Verhitten (10’, 100 graden Celsius) en centrifugeren
- Proteolyse (60’, 37-56 graden Celsius)
- Chaotrope zouten (ureum zorgt voor denaturatie van eiwitten, maar ook van nucle:inezuren)
Kernhoudende cellen in suspendie (bloed en beenmerg) en weefsels.
Er is differentiële centrifugatie op een dichtheidsgradiënt en lysis nodig. Bij weefsels moet dit
gehomogeniseerd worden en gedeparaffiniseerd in xyleen.
, DNA isolatie
DNA isolatie organisch en anorganisch
Bij organische DNA isolatie zijn de stappen:
1. NaOH, SDS toevoegen aan celsuspensie (lysis)
2. Door zuur bij de suspensie te doen ontstaat er een scheiding tussen DNA en celonderdelen (pellet
en supernatant)
3. Door extractie met phenol of chloroform verplaatst het DNA naar een waterachtige oplossing.
4. Door toevoegen van ethanol slaat het DNA neer op de bodem van het cupje.
5. DNA pellet resuspenderen in water op TE (Tris EDTA) buffer
Bij anorganische DNA isolatie zijn de stappen:
1. Tris, EDTA, SDS toevoegen aan celsuspensie voor lysis
2. Bij de gelyseerde cellen natrium-acetaat toevoegen wat zorgt voor neerslag van eiwitten
3. Door supernatant te pipetteren en hierbij Isopropanol toe te voegen slaat het DNA neer.
4. DNA pellet resuspenderen in water of TE (Tris EDTA) buffer
DNA isolatie Solid-phase
1. DNA bindt aan silica bij een hoog zout gehalte
2. Eventueel carrier RNA/DNA toevoegen voor recovery
3. Snelle wasprocedure door centrifugeren (spin columns) of magnetische beads
4. Toepassing in geautomatiseerde extractie procedures
RNA isolatie
RNA is zeer gevoelig voor afbraak. Daarom zijn er stricte maatregelen om afbraak van RNA te
voorkomen:
- Speciale gemarkeerde RNase-vrije werkplek of laboratorium (RNF)
- Altijd dragen van handschoenen
- Gebruik certified RNase free disposables
- Gebruik RNase-remmers: 0,1% diethyl pyrocarbonaat (DEPC) of Rnasin
- Tijdens extractie komen intracellulaire RNases vrij
Isolatie van polyA messenger RNA
Ongeveer 85% van totaal RNA is rRNA, het aandeel van mRNA is ~5%. Om mRNA te isoleren wordt er
een specifieke binding gevormd aan poly-dT bolletjes. Er vind elutie plaats met laag zout (bij
verwarming).
Detectie van Nucleïnezuren
Er zijn twee typen van detectie: direct en indirect. Onder directie detectie valt absorptie door middel
van fluorescerende kleurstoffen.
Bijvoorbeeld adenine absorbeert bij 260 nm.
De fluorescerende kleurstoffen zijn:
- ethidiumbromide
- Sybr green I (DNA) en Sybr green II (RNA)
Ethidiumbromide is een intercalerende stof. Dit betekend dat de stof tussen de nucleotiden in het
DNA kan gaan zitten. Dit is mogelijk door de structuur van het molecuul, deze lijkt namelijk op dat
van een purine/ pyrimidine. De stof ethidiumbromide is een mutageen, wat betekend dat het het
DNA aanpast bij intercalatie. De absorptiemaximum is bij 285 nm (UV licht) en moet voor afvoer
worden geïnactiveerd.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller esmebouwman. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.39. You're not tied to anything after your purchase.
