Samenvatting biomedische beeldvorming - microscopie

FLUORESCENTIE BEELDVORMING nt alle moleculen die terugvallen gaan
fluoresceren
HDFST 2: FLUORESCENTIE → sommigen vallen zonder kinetische E
PROBLEMEN MET MICRO- terug nr S0 = warmteverlies
SCOPIETECHNIEKEN • elke fluofoor = eigen unieke excitatie-
JABLONSKI DIAGRAM emissie spectrum
VORIGE LES > e- kunnen nr triplet toestand
> transmissiemicroscoop = gelimiteerd = langlevende toestand
STOKE SHIFT → toestand waar e- automatisch
contrast
> contrast versterken = maximale excitatie λ – maximale emissie λ E gaat verliezen/licht uit-
→ gn effect op bepaalde moleculen in → uniek getal: geeft aan hoe sterk E-verlies stuurt, mr licht v/e ander type
cel is tss excitatie & emissie (e&e) = fosforescentie
→ oplossing = fluorescentie → hoe groter stoke hoe gemakkelijker je
ze v. elkaar kan scheiden andere vorm v. lichtverlies (nt
fluorescent) met verlies v. e-
• veel  kleuren om moleculen te kleuren
= irreversibel
→ elke celbiologische structuur kan
gekleurd w.
BRIGHTNESS
• fluoresceïne = eerst gebruikte fluo
stof helderheid = = ε *QY
• best op zwarte achtergrond = DFM → bepaald dr extinctiecoëf. & QY
= geeft  E-niveau’s v. e- weer + in cel/organisme ook invloed v.
WAT IS FLUORESCENTIE? → S0 = grondtoestand omgeving
→ S1 = basis aangeslagen toestand vb. fluochroom werkt minder goed
= emissie v. licht = afgifte v. licht/E → S2 = aangeslagen toestand in zure condities
= na opname v. licht kunnen sommige = hoger E-niveau
moleculen waarneembare kleur v/e BRIGHTNESS V.
bepaalde λ uitstralen > blauw = grond → hoger E-niveau EXCTINCTIECOËFFICIËNT ORGANISCHE
vb. opname blauw → fluo groen a) afh. v. E zal e- zitten op een bepaald
wet van Lambert Beer:  = E/lengte*C FLUOFOREN
<--> excitatie = opname/absorptie licht/E vibratieniveau of rotatie niveau
= vermogen om licht op te nemen/absorberen
b) valt snel terug nr S1 & verliest I. DAPI = UV exciteerbaar
→ afh v. [molecule] & grootte recipiënt waar-
= fluoforen/fluorochromen kinetische E > uitsturen blauw licht
in het zich bevindt
→ kunnen licht verschuivingen induceren: c) terugvallen nr S0 > kan binden op DNA
opname licht bepaalde λ → afgifte → stuurt hierbij E uit in de vorm v. II. FLUORESCEÏNE = blauw exciteerb.
licht
QUANTUM YIELD (QY) → zeer helder, mr labiel: snel kapot
licht andere λ
d) dr veel E-verlies is emissie licht v/e = fluorescentie efficiëntie III. AUTOFLUORESCENTE STOFFEN
→ komt dr e op buitenste schil:
-
lagere E maw een hogere λ = #uitgestuurde γ / #geabsorbeerde γ vb. tyrosine & NADH
a) E opnemen ingestuurd licht
(hoe lagerλ, hoe meer E) > rood = vibrationele relaxatie vb. 80/100 = quantumefficiëntie = 80% → lage helderh.
= warmte verlies → verval v. 20%
b) nr aangeslagen toestand
> groen = fluorescentie in nanosec. → gn fluorescentie uitgestuurd → organische moleculen hebben ge-
c) terugvallen nr grondtoestand
dr uitstralen v. licht • elke fluofoor eigen optimale meenschappelijk kenmerk
excitatie E = benzeenringen

, LIFETIME DIASCOPISCHE OPSTELLING
elke fluofoor = unieke levensduur
→ valt na bepaald #nanosec terug
→ halfwaardetijd = duur waarbij 50% fluorescentie = eigenlijk inefficiënt
v/d fluorescentie is verminderd
(in levende systemen dr veel > veel excitatie licht nodig
beïnvloed: pH, interacties,...) > inefficiënte filters
> veel achtergrondlicht
FLUORESCENTIE > fluorescentie gaat in alle richtingen
oplossing
MICROSCOOP = EPISCOPISCHE OPSTELLING
= geïnverteerde microscoop
→ objecten staan onderaan EPISCOPISCHE OPSTELLING FILTER KUBUS
→ voordeel: je kan makkelijk aan staal
a) wit licht komt v. rechts
> lichtbron = wit licht → moet nog gefilterd w.
b) passeert excitatiefilter: laat hier enkel CONFOCALE
→ juiste λ uithalen vr. excitatie
→ ontstaan fluo: emissielicht op-
blauw licht dr MICROSCOOP
c) blauw licht botst tegen dichroïsche optical knife = 3D imaging in levende
vangen spiegel (kort reflecteren & lang door)
→ probleem: e&e hebben groot stalen -> ziet wel fluo
→ gaan een hoek inbouwen dr d) korte nr boven: exciteert fluochroom
spectrum = overlappen met elkaar → gebaseerd op punt-belichting &
dichroïsche spiegel = lost bovenstaande → ontstaan groen fluo licht = langeλ detectie
problemen op e) fluo licht w. doorgelaten dr spiegel
λ scheiden met FILTERS > puntbelichting zorgt ervoor dat je
f) passeert emissiefilter: laat enkel weet vanwaar licht komt
scheidt excitatie v. emissie dr korteλ emissielicht dr die we willen (gn last v.
3 grote groepen: > enige licht dat gecapteerd w. komt
(excitatie) te reflecteren & langeλ reflecties v. excitatielicht) uit focusvlak
> bandpass = doorlaten bepaalde band- g) fluo licht komt bij oog terecht
(emissie) dr te laten > detecteren 1 vr 1 punten dr pinhole
breedte
vb. 550/60: piek ligt op 550 & langs = kleine opening vlak vr detector die
→ e-&e-filters & dichroïsche spiegel zorgen ervoor zorgt dat punt dat we
beide kanten nog -30 & +30 samen vr perfecte scheiding v. e&e v/e
→ bereik gaat dus v. 520-580 detecteren komt uit focusvlak
fluochroom
> short pass = laten λ dr die korter zijn
dan cut-offλ v. filter > hoe groter NA = hoe meer licht opgevangen
vb. 550 → alles onder 550 gaat dr = NA4
> long pass = laten λ dr die langer zijn > hoe groter vergroting, hoe kleiner stukje dat
dan cut-offλ v. filter je ziet, hoe minder licht je opvangt = M2
vb. 550 → alles boven 550 gaat dr > helderh. omgekeerd evenredig met kwadraat
v. vergroting = NA4/M2
> wide field microscoop: grijs beeld met
matige intensiteit -> ziet gn fluo

, FLUORESCENTE MARKERS
> basale kleurstoffen: vb. DAPI
> anorganische equivalenten gebaseerd
op elementen zoals cadmium & selenium
→ super toxisch, mr zeer klein
> rood = licht uit focus vlak • grootte beslist over
→ botst tegen wand: nt gedetecteerd emissiespectrum dat ze hebben
> geel = licht vr focus vlak • nauw emissiespectrum dan
→ afgestoten dr pinhole: nt gedet. organische kleurstoffen
> groen = licht in focus vlak • allemaal geëxciteerd in UV gebied
→ gaat dr pinhole: volledig gecapteerd > gespecialiseerde EW, AL, probes,...

DUS ESSENTIE: in focus licht opvangen & • fluorescent gelabeld → kan
zoveel mogelijk uit focus licht weg gedetecteerd w.
→ nadeel: laat minder licht dr, dus • directe fluorescentie
donkerder = 1 primair AL
→ voordeel: wel meer detail  weinig signaal
 kostelijk
 GEWONE MICROSCOPIE  nt zo gevoelig
 wel specifiek
> duur: 2sec -> minder belasting op staal
→ snelle processen nt gedetecteerd • indirecte fluorescentie
→ oplossing: lichtbundel schijnen op = 2 AL: primair & daarop bindt
secundair
plaat met kleine gaatjes
 veel signaal: meer S-AL kunnen
→ hierdr  punten tegelijk be-
binden op 1 P-AL
licht
> allemaal aparte puntbelichtingsbronnen  goedkoper
> schijf enkele keren draaien om volledig  meer gevoelig
beeld te krijgen  minder specifiek
→ spinning disk houdt veel licht tegen
→ 2de schijf toevoegen met micro-
lenzen
→ licht gefocusseerd in gaatjes
> dikke stalen = probleem
→ veel breking