Dit is een samenvatting van het onderdeel microscopie van het vak biomedische beeldvorming. Je kunt hier alles in terugvinden, BEHALVE HFDST1 en een deel van HFDST4. De samenvatting is gemaakt adhv de PPT van prof. De Vos en notities genomen tijdens de lessen. Eventueel gebruikte illustraties komen...
FLUORESCENTIE BEELDVORMING nt alle moleculen die terugvallen gaan
fluoresceren
HDFST 2: FLUORESCENTIE → sommigen vallen zonder kinetische E
PROBLEMEN MET MICRO- terug nr S0 = warmteverlies
SCOPIETECHNIEKEN • elke fluofoor = eigen unieke excitatie-
JABLONSKI DIAGRAM emissie spectrum
VORIGE LES > e- kunnen nr triplet toestand
> transmissiemicroscoop = gelimiteerd = langlevende toestand
STOKE SHIFT → toestand waar e- automatisch
contrast
> contrast versterken = maximale excitatie λ – maximale emissie λ E gaat verliezen/licht uit-
→ gn effect op bepaalde moleculen in → uniek getal: geeft aan hoe sterk E-verlies stuurt, mr licht v/e ander type
cel is tss excitatie & emissie (e&e) = fosforescentie
→ oplossing = fluorescentie → hoe groter stoke hoe gemakkelijker je
ze v. elkaar kan scheiden andere vorm v. lichtverlies (nt
fluorescent) met verlies v. e-
• veel kleuren om moleculen te kleuren
= irreversibel
→ elke celbiologische structuur kan
gekleurd w.
BRIGHTNESS
• fluoresceïne = eerst gebruikte fluo
stof helderheid = = ε *QY
• best op zwarte achtergrond = DFM → bepaald dr extinctiecoëf. & QY
= geeft E-niveau’s v. e- weer + in cel/organisme ook invloed v.
WAT IS FLUORESCENTIE? → S0 = grondtoestand omgeving
→ S1 = basis aangeslagen toestand vb. fluochroom werkt minder goed
= emissie v. licht = afgifte v. licht/E → S2 = aangeslagen toestand in zure condities
= na opname v. licht kunnen sommige = hoger E-niveau
moleculen waarneembare kleur v/e BRIGHTNESS V.
bepaalde λ uitstralen > blauw = grond → hoger E-niveau EXCTINCTIECOËFFICIËNT ORGANISCHE
vb. opname blauw → fluo groen a) afh. v. E zal e- zitten op een bepaald
wet van Lambert Beer: = E/lengte*C FLUOFOREN
<--> excitatie = opname/absorptie licht/E vibratieniveau of rotatie niveau
= vermogen om licht op te nemen/absorberen
b) valt snel terug nr S1 & verliest I. DAPI = UV exciteerbaar
→ afh v. [molecule] & grootte recipiënt waar-
= fluoforen/fluorochromen kinetische E > uitsturen blauw licht
in het zich bevindt
→ kunnen licht verschuivingen induceren: c) terugvallen nr S0 > kan binden op DNA
opname licht bepaalde λ → afgifte → stuurt hierbij E uit in de vorm v. II. FLUORESCEÏNE = blauw exciteerb.
licht
QUANTUM YIELD (QY) → zeer helder, mr labiel: snel kapot
licht andere λ
d) dr veel E-verlies is emissie licht v/e = fluorescentie efficiëntie III. AUTOFLUORESCENTE STOFFEN
→ komt dr e op buitenste schil:
-
lagere E maw een hogere λ = #uitgestuurde γ / #geabsorbeerde γ vb. tyrosine & NADH
a) E opnemen ingestuurd licht
(hoe lagerλ, hoe meer E) > rood = vibrationele relaxatie vb. 80/100 = quantumefficiëntie = 80% → lage helderh.
= warmte verlies → verval v. 20%
b) nr aangeslagen toestand
> groen = fluorescentie in nanosec. → gn fluorescentie uitgestuurd → organische moleculen hebben ge-
c) terugvallen nr grondtoestand
dr uitstralen v. licht • elke fluofoor eigen optimale meenschappelijk kenmerk
excitatie E = benzeenringen
, LIFETIME DIASCOPISCHE OPSTELLING
elke fluofoor = unieke levensduur
→ valt na bepaald #nanosec terug
→ halfwaardetijd = duur waarbij 50% fluorescentie = eigenlijk inefficiënt
v/d fluorescentie is verminderd
(in levende systemen dr veel > veel excitatie licht nodig
beïnvloed: pH, interacties,...) > inefficiënte filters
> veel achtergrondlicht
FLUORESCENTIE > fluorescentie gaat in alle richtingen
oplossing
MICROSCOOP = EPISCOPISCHE OPSTELLING
= geïnverteerde microscoop
→ objecten staan onderaan EPISCOPISCHE OPSTELLING FILTER KUBUS
→ voordeel: je kan makkelijk aan staal
a) wit licht komt v. rechts
> lichtbron = wit licht → moet nog gefilterd w.
b) passeert excitatiefilter: laat hier enkel CONFOCALE
→ juiste λ uithalen vr. excitatie
→ ontstaan fluo: emissielicht op-
blauw licht dr MICROSCOOP
c) blauw licht botst tegen dichroïsche optical knife = 3D imaging in levende
vangen spiegel (kort reflecteren & lang door)
→ probleem: e&e hebben groot stalen -> ziet wel fluo
→ gaan een hoek inbouwen dr d) korte nr boven: exciteert fluochroom
spectrum = overlappen met elkaar → gebaseerd op punt-belichting &
dichroïsche spiegel = lost bovenstaande → ontstaan groen fluo licht = langeλ detectie
problemen op e) fluo licht w. doorgelaten dr spiegel
λ scheiden met FILTERS > puntbelichting zorgt ervoor dat je
f) passeert emissiefilter: laat enkel weet vanwaar licht komt
scheidt excitatie v. emissie dr korteλ emissielicht dr die we willen (gn last v.
3 grote groepen: > enige licht dat gecapteerd w. komt
(excitatie) te reflecteren & langeλ reflecties v. excitatielicht) uit focusvlak
> bandpass = doorlaten bepaalde band- g) fluo licht komt bij oog terecht
(emissie) dr te laten > detecteren 1 vr 1 punten dr pinhole
breedte
vb. 550/60: piek ligt op 550 & langs = kleine opening vlak vr detector die
→ e-&e-filters & dichroïsche spiegel zorgen ervoor zorgt dat punt dat we
beide kanten nog -30 & +30 samen vr perfecte scheiding v. e&e v/e
→ bereik gaat dus v. 520-580 detecteren komt uit focusvlak
fluochroom
> short pass = laten λ dr die korter zijn
dan cut-offλ v. filter > hoe groter NA = hoe meer licht opgevangen
vb. 550 → alles onder 550 gaat dr = NA4
> long pass = laten λ dr die langer zijn > hoe groter vergroting, hoe kleiner stukje dat
dan cut-offλ v. filter je ziet, hoe minder licht je opvangt = M2
vb. 550 → alles boven 550 gaat dr > helderh. omgekeerd evenredig met kwadraat
v. vergroting = NA4/M2
> wide field microscoop: grijs beeld met
matige intensiteit -> ziet gn fluo
, FLUORESCENTE MARKERS
> basale kleurstoffen: vb. DAPI
> anorganische equivalenten gebaseerd
op elementen zoals cadmium & selenium
→ super toxisch, mr zeer klein
> rood = licht uit focus vlak • grootte beslist over
→ botst tegen wand: nt gedetecteerd emissiespectrum dat ze hebben
> geel = licht vr focus vlak • nauw emissiespectrum dan
→ afgestoten dr pinhole: nt gedet. organische kleurstoffen
> groen = licht in focus vlak • allemaal geëxciteerd in UV gebied
→ gaat dr pinhole: volledig gecapteerd > gespecialiseerde EW, AL, probes,...
DUS ESSENTIE: in focus licht opvangen & • fluorescent gelabeld → kan
zoveel mogelijk uit focus licht weg gedetecteerd w.
→ nadeel: laat minder licht dr, dus • directe fluorescentie
donkerder = 1 primair AL
→ voordeel: wel meer detail weinig signaal
kostelijk
GEWONE MICROSCOPIE nt zo gevoelig
wel specifiek
> duur: 2sec -> minder belasting op staal
→ snelle processen nt gedetecteerd • indirecte fluorescentie
→ oplossing: lichtbundel schijnen op = 2 AL: primair & daarop bindt
secundair
plaat met kleine gaatjes
veel signaal: meer S-AL kunnen
→ hierdr punten tegelijk be-
binden op 1 P-AL
licht
> allemaal aparte puntbelichtingsbronnen goedkoper
> schijf enkele keren draaien om volledig meer gevoelig
beeld te krijgen minder specifiek
→ spinning disk houdt veel licht tegen
→ 2de schijf toevoegen met micro-
lenzen
→ licht gefocusseerd in gaatjes
> dikke stalen = probleem
→ veel breking
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller evevlaemynck. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.46. You're not tied to anything after your purchase.
