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Técnicas de Hibridación de Ácidos Nucleicos.
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Técnicas de Hibridación de ácidos nucleicos, en medio sólidos, líquido e in situ (FISH))
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UNIDAD 8: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS.HIBRIDACIÓN .
Proceso de unión artificial de dos cadenas monocatenarias mediante la
complementariedad de bases para formar una cadena bicatenaria híbrida.
- ADN + ADN. Homodúplex.
- ARN + ARN. Homodúplex.
- ADN + ARN. Heterodúplex.
Su aplicación es detectar consecuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN/ ARN)
mediante el empleo de fragmentos complementarios o sondas que se marcan para
poder ser visualizados.
1. LOS ELEMENTOS BÁSICOS PARA LA DETECCI ÓN DE UNA SECUENCIA.
SECUENCIA DIANA. SONDA. MARCADOR.
Secuencia concreta de Bicatenarias Monocatenarias.
bases nitrogenadas (BN) .
que se pretende detectar Cadena de nucleótidos cuya secuencia de
en la muestra problema. BN es complementaria a la secuencia diana.
2. PRINCIPIO BÁSICO DE HIBRIDACIÓN.
1. DESNATURALIZACIÓN:
Una molécula de doble hebra se convierte en 2 moléculas de hebra sencilla. Separación de las dos cadenas de una
molécula bicatenaria debido a la rotura de los puentes de hidrógeno entre pares de bases.
AGENTES DESNATURALIZANTES:
- Temperatura:
o A mayor absorción (260 nm), mayor temperatura y mayor
porcentaje de desnaturalización.
o Curva sigmoidea:
▪ Zona A: Valor constante de longitud de onda es A260.
ADN bicatenario sin desnaturalizar 0%.
▪ Zona B: Aumento de absorbancia a 260 nm.
Desnaturalización progresiva.
▪ Zona C: Pendiente nula, valor casi constante de
▪ A260 ADN 100% desnaturalizado.
o Correlación lineal con su contenido de G + C. Mayor contenido
de G + C, es mayor cantidad de tripletes de enlaces por lo tanto
mayor temperatura necesaria.
- Agentes químicos: Interactúan directamente con las bases nitrogenadas,
compitiendo con la formación de pH entre las bases complementarias,
con lo que impiden un apareamiento correcto entre ellas. Estos agentes
químicos son: Urea, formamida y formaldehido.
2. RENATURALIZACIÓN:
Dos moléculas de hebra sencilla
se convierten en 1 molécula de
doble hebra. A mayores
cadenas, mayor posibilidad de
reencontrarse. Curva de
renaturalización:
, 3. TÉCNICAS Y ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN:
Las técnicas de hibridación se diferencian por:
- El tipo de ácido que se pretende detectar.
- El tipo de sonda que se va a utilizar.
- El tipo de marcaje de sonda.
- El medio o soporte (sólido, líquido o in situ) en el que se realiza la hibridación.
Los ensayos de hibridación se clasifican en 3 grupos;
HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA. HIBRIDACIÓN IN SITU. HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO.
Es la más sencilla y rápida (1h). No se necesita extracción de ácidos La muestra de ADN diana se inserta
La reacción de hibridación se realiza nucleicos. en una matriz sólida a la que se le
en disolución. La sonda se aplica sobre muestras añade una solución de hibridación
Técnicas: Captura de híbrido y ADN en su ubicación natural (cortes de con sondas marcadas.
ramificado. tejidos, células intactas). Técnicas: Southem, Northem blot,
Uso: Detección de virus. CHG, Microrrays de ADN.
SONDAS.
Fragmento de ácido nucleico (ADN O ARN) que ha sido marcado con enzimas, sustratos antigénicos,
quimioluminiscencia o radioisótopos para su detección y que se pueden unir a una secuencia complementaria diana
de ácido nucleico.
1. ¿CÓMO ELEGIR SONDA?
ESPECIFICIDAD:
Capacidad que tiene la sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que hibridar. Las sondas muy
pequeñas (14- 16 nucleótidos) se unen de forma inespecífica.
SENSIBILIDAD:
Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda- diana, dependiendo del marcaje.
2. TIPOS DE SONDAS DEPENDIENDO DE LA NATURALEZA DEL ÁCIDO NUCLEICO .
1. SONDAS DE ADN:
Son las más utilizadas, son fáciles de obtener en grandes cantidades, presentan gran versatilidad en cuanto tamaño y
marcaje y sus cinéticas de desnaturalización y renaturalización son las más estudiadas.
SEGÚN EL PROCESO DE OBTENCIÓN SE DISTINGUEN:
Clonación de ADN (0,1 – 100kb): PCR (0,1 – 20kb):
Se obtiene por un proceso de clonación. Se obtienen por el proceso de PCR (amplifica el
Características de las sondas: fragmento que nos interesa como sonda mediante la
- Son bicatenarias. reacción en cadena de la polimerasa). Se requiere
- Gran tamaño (admiten un gran número de conocer cebadores.
moléculas marcadoras, por lo tanto, mayor Características de las sondas:
sensibilidad. - Son bicatenarias.
- No suelen hibridar inespecíficamente, por lo - Tamaño intermedio.
tanto, mayor especificidad.
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