Microscopía
1. Propiedades ópticas del microscopio
1.1. Aumento
● Es el número de veces que se aumenta el tamaño real de un objeto.
● Capacidad del microscopio de agrandar la imagen para ser vista por el ojo humano.
● El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura, mayor será el aumento.
1.2. Poder de resolución
El poder de resolución está determinado por su límite de resolución que es la distancia mínima entre dos
puntos necesaria para distinguirlos.
1.3. Profundidad de foco
● Es la posibilidad de enfocar correctamente un objeto de cierto grosor.
● Cuanto menor sea el objetivo mayor es la profundidad de foco.
● A MENOR aumento, MAYOR campo.
2. Tipos de microscopios
2.1. Microscopía fotónica especial
a) Microscopio de campo oscuro
El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás.
Ventaja: Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmenta,
invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra (sin matarla).
Inconveniente: Imágenes con poca resolución.
Aplicaciones:
- Observar especímenes de tamaño pequeño no coloreados.
- Observar células móviles difíciles de observar con microscopía ordinaria.
- Estudio de procesos biológicos como la mitosis o la migración celular.
b) Microscopio de contraste de fases
Principio:
- Mismo principio que el de campo oscuro.
- Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y
en distintas partes de una muestra de tejido.
- En este caso la luz sin desviar sí entra en el objeto pero con una intensidad diferente a la intensidad
que se obtiene cuando la luz es desviada en una u otra dirección.
Ventajas:
- Aumenta muchísimo el contraste.
- Útil para células vivas. Permite observar células sin colorear.
Inconveniente: halo alrededor de la muestra.
c) Microscopio de interferencia o de Novarski
Principio:
- Es una variación de la microscopía de contraste de fases.
- En este caso se utiliza luz polarizada, cuando la muestra desvía la luz cambia el tono del fondo
generando un arco de oscuros y claros en función de cómo se desvíe la luz polarizada.
- Esto genera una sensación de tridimensionalidad.
Ventajas: Elimina el halo que aparece en la microscopía de fases.
Aplicaciones:
- Células vivas no coloreadas.
- Muestras que no permitan el contraste de fases.
- Técnicas de fertilización in vitro.
Instrumentación:
- Filtro polarizador y prisma.
- NO modular de diafragma, ni anillo de fase.
d) Microscopio de fluorescencia
Principio:
- La fluorescencia es un fenómeno muy rápido que consiste en que los objetos que absorben luz a una
determinada onda (UV) se excitan y liberan energía emitiendo luz de una longitud de onda mayor.
- Esta longitud de onda que emiten está dentro del espectro visible y suele ser de color rojo, verde,
amarillo y azul.
- Para esta técnica se utilizan fluorocromos.
- Fluorocromo: marcador colorante fluorescente usado para crear contraste en distintas zonas de los
especímenes.
- Fluoróforo: parte de la molécula que le da la propiedad de producir la fluorescencia.
- Cada fluorocromo tiene su propio espectro de absorción y de emisión entre lo que se encuentra el
naranja de acridina, la rodamina y fluoresceína.
Aplicaciones: la fluorescencia permite el marcaje selectivo de moléculas y compuestos celulares pequeños lo
que aumenta el contraste y la resolución. La técnica más utilizada de fluorescencia es la inmunofluorescencia.
- Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.
- Estudios de células normales y patológicas.
1. Propiedades ópticas del microscopio
1.1. Aumento
● Es el número de veces que se aumenta el tamaño real de un objeto.
● Capacidad del microscopio de agrandar la imagen para ser vista por el ojo humano.
● El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura, mayor será el aumento.
1.2. Poder de resolución
El poder de resolución está determinado por su límite de resolución que es la distancia mínima entre dos
puntos necesaria para distinguirlos.
1.3. Profundidad de foco
● Es la posibilidad de enfocar correctamente un objeto de cierto grosor.
● Cuanto menor sea el objetivo mayor es la profundidad de foco.
● A MENOR aumento, MAYOR campo.
2. Tipos de microscopios
2.1. Microscopía fotónica especial
a) Microscopio de campo oscuro
El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás.
Ventaja: Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmenta,
invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra (sin matarla).
Inconveniente: Imágenes con poca resolución.
Aplicaciones:
- Observar especímenes de tamaño pequeño no coloreados.
- Observar células móviles difíciles de observar con microscopía ordinaria.
- Estudio de procesos biológicos como la mitosis o la migración celular.
b) Microscopio de contraste de fases
Principio:
- Mismo principio que el de campo oscuro.
- Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y
en distintas partes de una muestra de tejido.
- En este caso la luz sin desviar sí entra en el objeto pero con una intensidad diferente a la intensidad
que se obtiene cuando la luz es desviada en una u otra dirección.
Ventajas:
- Aumenta muchísimo el contraste.
- Útil para células vivas. Permite observar células sin colorear.
Inconveniente: halo alrededor de la muestra.
c) Microscopio de interferencia o de Novarski
Principio:
- Es una variación de la microscopía de contraste de fases.
- En este caso se utiliza luz polarizada, cuando la muestra desvía la luz cambia el tono del fondo
generando un arco de oscuros y claros en función de cómo se desvíe la luz polarizada.
- Esto genera una sensación de tridimensionalidad.
Ventajas: Elimina el halo que aparece en la microscopía de fases.
Aplicaciones:
- Células vivas no coloreadas.
- Muestras que no permitan el contraste de fases.
- Técnicas de fertilización in vitro.
Instrumentación:
- Filtro polarizador y prisma.
- NO modular de diafragma, ni anillo de fase.
d) Microscopio de fluorescencia
Principio:
- La fluorescencia es un fenómeno muy rápido que consiste en que los objetos que absorben luz a una
determinada onda (UV) se excitan y liberan energía emitiendo luz de una longitud de onda mayor.
- Esta longitud de onda que emiten está dentro del espectro visible y suele ser de color rojo, verde,
amarillo y azul.
- Para esta técnica se utilizan fluorocromos.
- Fluorocromo: marcador colorante fluorescente usado para crear contraste en distintas zonas de los
especímenes.
- Fluoróforo: parte de la molécula que le da la propiedad de producir la fluorescencia.
- Cada fluorocromo tiene su propio espectro de absorción y de emisión entre lo que se encuentra el
naranja de acridina, la rodamina y fluoresceína.
Aplicaciones: la fluorescencia permite el marcaje selectivo de moléculas y compuestos celulares pequeños lo
que aumenta el contraste y la resolución. La técnica más utilizada de fluorescencia es la inmunofluorescencia.
- Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.
- Estudios de células normales y patológicas.
