Samenvatting zelfstudieopdracht 8: H3 uit handboek (examen 15/20)
25 views 1 purchase
Course
Moleculaire Biologie
Institution
Universiteit Antwerpen (UA)
Book
Genetics and Genomics in Medicine
Het vak moleculaire biologie werkt ook met zelfstudieopdrachten. Hier vind je een samenvatting van zelfstudieopdracht 8 wat in het handboek overeenkomt met H3 DNA technieken. (examen 15/20)
Hoofdstuk 3: DNA-technieken
1. DNA klonen
1.1 DNA klonen: fractioneren en zuiveren van DNA door cellen te transformeren met
recombinant-DNA
Het klonen van DNA in cellen is een manier om DNA-sequenties te zuiveren
Er kunnen grote hoeveelheden (vele identieke kopieën) van een DNA-sequentie worden
bereid, zodat de sequentie kan worden bestudeerd
Betrokken cellen: vaak bacteriële + minder vaak gistcellen
Fase 1 transformatie: cellen worden behandeld (cellen waarin men DNA-moleculen
gaat aanbrengen die men wil klonen)
Fase 2: het te klonen DNA wordt covalent verbonden (geligeerd) met een vector-
DNA-sequentie zal helpen bij replicatie in de gastcellen
o DNA-fragmenten + vectormoleculen= vorming van een kunstmatig
recombinant DNA
o kan lineair / circulair zijn
lineair: bij DNA gisten
circulair: bij DN A
Het transformatieproces is selectief
Als vreemd DNA in een cel komt: meestal maar 1 DNA-molecule door cel opgenomen
Als meerdere vreemde DNA-fragmenten aanbieden aan celpopulatie: DNA-
fragmenten willekeurig toegewezen aan verschillende cellen
celpopulatie is sorteerkantoor die vreemde DNA-fragmenten kan verdelen
Celklonen ontstaan vanuit 1 getransformeerde cel
A) Amplificatie
Kloneringssystemen: mogelijk om grote hoeveelheden van gekloond DNA te maken
ingebrachte DNA geamplificeerd tot zeer hoge kopie-aantallen
Om twee redenen mogelijk:
1) 1 bacterie met gekloond DNA kan zich snel delen
zo veel identieke klonen van bacteriecellen produceren
hebben allemaal dezelfde vreemde DNA-sequentie
2) Sommige vectormoleculen kunnen zich binnen een bacteriecel repliceren tot vrij hoge
kopie-aantallen (gebeurt onafhankelijk van gastheer chromosoom)
als er covalente binding is met vreemde DNA-sequentie, zal ook die binnen de cel
worden vermeerderd (vectoren hebben eigen replicatie-oorsprong)
B) Vectormoleculen
Om menselijk DNA te kunnen vermenigvuldigen in bacteriële cellen / gistcellen, hebben
DNA-moleculen een geschikte replicatieherkomst nodig
= een DNA-sequentie die de DNA-replicatie in dat celtype in gang zet
die DNA-sequentie = repliconen
Klonen in bacteriën: extrachromosomale replicons gebruikt
repliceren onafhankeliijk van bacteriële chromosoom
2 nuttige bronnen: plasmiden + bacteriofagen
o Plasmiden= kleine cirkelvormige dubbelstrengs-DNA's die zich in sommige
gevallen tot hoge kopie-aantallen kunnen repliceren
(antibiotica resistentie genen komen veel terug op plasmiden)
1
, o Bacteriofagen= bacteriële virussen
klonen van zeer grote DNA-fragmenten in gist: chromosomale replicatieoorsprong
gebruikt
Wanneer is het een bruikbare kloneringsvector?
oorspronkelijke plasmide, de bacteriofaag of een ander replicon moet genetisch
worden gemodificeerd
zo efficiënt vreemd DNA aan kunnen koppelen
en zo kunnen getransformeerde cellen gemakkelijk worden herkend
Naakt vector-DNA= vector bevat geen ander DNA
Klassen klonerende vectoren:
Vector Gastheercel Uitleg
Plasmide E. coli - onafhankelijke replicatie van GH
chromosoom
- kunnen hoge kopie- aantallen bereiken
- op grote schaal gebruikt voor het kloneren van kleine DNA-
fragmenten
Bacterieel kunstmatig E. coli - is een gewijzigde plasmidevector
chromosoom (BAC) - heeft strikte beperking van het kopiegetal grote fragmenten
kunnen stabiel worden vermeerderd
Gist kunstmatig Saccharomyces recombinanten zijn kleine lineaire chromosomen die grotendeels
chromosoom (YAC) cerevisiae bestaan uit menselijk of ander vreemd DNA
C) Fysieke kloonscheiding
Fysieke kloonscheiding voor cellen die verschillende DNA-fragmenten hebben
opgenomen
Berust op de vorming van fysisch gescheiden celkolonies
o Uitplaten van getransformeerde bacteriële cellen (uitplaten: cellen in
petrischaaltjes in agar)
o Goed getransformeerde cellen: groeien, vermenigvuldigen
vormen van elkaar gescheiden celkolonies
elke celkolonie: bestaat uit celklonen (identieke afstammende cellen)
die afkomstig van 1 getransformeerde cel
bevatten elk hetzelfde vreemde DNA-molecuul
o een goed gescheiden celkolonie kan fysiek worden geplukt + gebruikt om groei
op gang te brengen van een grote cultuur
grotere celcultuur van identieke cellen met zelfde vreemd DNA-molecule
resultaat: grote amplificatie van 1 enkele DNA-sequentie
o Daarna kan het gekloonde vreemde DNA uit de bacteriecellen worden gezuiverd
D) Het maken van recombinant DNA
Hoe recombinant DNA maken?
Elk DNA-fragment covalent binden (geligeerd) door DNA-ligase aan een vector-DNA-
molecule recombinant-DNA gevormd
o Eerst moet het nodige DNA en vector-DNA geprepareerd worden
zodat goed kunnen samengevoegd worden
Recombinant-DNA in een geschikte GHcel getransporteerd (bacteriecel / gistcel)
2
, Kleine DNA-fragmenten gebruiken voor kloning in cellen Hoe?
Heel lange nucleaire DNA-moleculen gefragmenteerd tot nog steeds vrij lange
fragmenten (met heterogene uiteinden)
De lange fragmenten moeten nog kleiner gemaakt worden + meer uniforme
eindsequenties hebben ( door restrictie enzymen) om ligatie te vergemakkelijken
Recombinant-DNA-technologie: gebruik van restrictie-endonucleasen om het DNA op
bepaalde plaatsen door te knippen
Hierdoor DNA knippen tot kleine fragmenten met uniforme eindsequenties
hierdoor gemakkelijk door DNA-ligase kunnen worden samengevoegd tot
vectormoleculen
Restrictie-enzymen zijn op zelfde wijze afgesneden!!
Meeste recombinant-DNA's (DNA + vector) cirkelvormig, maar kunnen in GHcel na
klonatie ook lineaire vorm krijgen bv. bij gistcellen "yeast artificial chromosome" (YAC)
E) Restrictie endonucleases
De natuurlijke rol van restrictie-endonucleasen: verdediging van de gastheercel:
Restrictie-endonucleasen= restrictienucleasen
zijn een klasse bacteriële enzymen
herkennen specifieke korte-sequentie-elementen in een dubbelstrengig
DNA-molecuul
splitsen DNA op beide strengen (binnen de herkenningssequenties
(=restrictieplaats) of in de nabijheid ervan)
doel (oorspr): bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers (bacteriofagen)
o resitrictie endonucleasen kunnen de binnendringende ziekteverwekker
uitschakelen door het DNA van de ziekteverwekker selectief in kleine
stukjes te knippen
Bescherming eigen genoom: GHcel produceert DNA-methyltransferase dat zijn
eigen DNA methyleert eigen DNA kan niet splitsen door restrictienucleasen
Restrictie nucleasen als moleculair genetische hulpmiddelen
Verschillende klassen van restrictienucleasen type II bespreking
gebruikt bij het manipuleren + analyseren van DNA
herkennen korte sequentie-elementen die typisch palindromen zijn
(de 5ʹ→3ʹ-sequentie is op beide strengen gelijk bv. GAATTC wordt complementair
CTTAAG)
splitsen DNA op beide strengen (binnen
herkenningssequenties (=restrictieplaats) of in
de nabijheid ervan)
De splitsing: vaak op asymmetrische posities
binnen de twee strengen om fragmenten te
produceren met overhangende 5ʹ uiteinden of
overhangende 3ʹ uiteinden
DNA en vectormolecuul op zelfde wijze
geknipt!! zo gemakkelijk ligeren door DNA
ligase en recombinant DNA-moleculen gemaakt
3
, Vectormoleculen bv. plasmiden bevatten restrictieplaatsen voor
restrictienucleasen
1.2 DNA-bibliotheken en de toepassingen en beperkingen van het klonen van DNA
Klonen gebruikt om DNA-bibliotheken te maken= verzamelingen van DNA-klonen die alle
soorten DNA-sequenties in een complex uitgangsmateriaal vertegenwoordigen
Een goede genomische DNA-bibliotheek zou zoveel verschillende DNA-klonen bevatten dat
er een goede kans is dat de bibliotheek zowat alle verschillende DNA-sequenties in het
genoom zou bevatten.
Alternatief: maken van een gen-gecentreerde DNA-bibliotheken
Er zijn ook DNA sequenties die niet coderen voor eiwitten, maar voor RNA RNA kan niet
worden gekloond
Men ging DNA-kopieën maken mbv DNA-polymerase
Door omgekeerde transcriptase: enkelstrengig RNA-sjabloon kopiëren in een
complementaire DNA-kopie (cDNA)
Als cDNA-streng gemaakt: oorspronkelijke RNA vernietigd door behandeling met
ribonuclease + de gekopieerde DNA-streng wordt gekopieerd om een
complementair DNA te maken, waardoor dubbelstrengs cDNA wordt gemaakt
gebruikt om cDNA-bibliotheek te maken
Het bereik van DNA-klonen kan in een cDNA-bibliotheek variëren naargelang het cDNA
omdat verschillende genen in verschillende celtypes tot expressie komen
Nadeel: het klonen van DNA kruipt veel tijd en moeite in
2. PCR (polymerase kettingreactie)
2.1 De grondbeginselen van de polymerasekettingreactie (PCR)
PCR= een celvrije methode voor de amplificatie van DNA
PCR is snel + maakt parallelle amplificatie mogelijk van DNA-sequenties uit meerdere
DNA-monsters
Gebruik van hittestabiel DNA-polymerase om kopieën te synthetiseren van een klein
vooraf bepaald DNA-segment
Voor de synthese van een nieuwe DNA-streng: DNA-polymerase heeft een
enkelstrengs oligonucleotideprimer nodig
bindt aan een specifieke complementaire sequentie binnen het start-DNA.
o Is een kort enkelstrengig DNA of RNA stukje
o Oligonucleotiden +- 20 nucleotiden lang of meer
o Moet complementair zijn aan doelsequentie
Proces:
1) Denaturatie:
DNA strengen van elkaar gescheiden door verwarming tot 95°C
Waterstofbruggen verbroken
2) Hybridisatie
De 2 DNA-primers (oligonucleotide) binden aan enkelstrengig deel DNA
2 primers want 1 binden voor elk enkelstrengig DNA
40°C- 60°C
3) Proliferatie/DNA-synthese:
Taq DNA polymerase bouwt complementaire nucleotide in op
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller VFua. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.26. You're not tied to anything after your purchase.
