100% satisfaction guarantee Immediately available after payment Both online and in PDF No strings attached
logo-home
Previously searched by you
Previously searched by you
logo
Samenvatting zelfstudieopdracht 8: H3 uit handboek (examen 15/20) $4.30
Add to cart
Quickly navigate to
Preview
  2.  
  3. Universiteit Antwerpen (UA)
  4.  
  5. Biomedische Wetenschappen
  6.  
  7. Moleculaire Biologie

Summary

Samenvatting zelfstudieopdracht 8: H3 uit handboek (examen 15/20)
 1 purchase
  • Course
  • Moleculaire Biologie
  • Institution
  • Universiteit Antwerpen (UA)
  • Book
  • Genetics and Genomics in Medicine

Het vak moleculaire biologie werkt ook met zelfstudieopdrachten. Hier vind je een samenvatting van zelfstudieopdracht 8 wat in het handboek overeenkomt met H3 DNA technieken. (examen 15/20)

Preview 4 out of 15  pages

Document information

  • No
  • Hoofdstuk 3,5,10
  • March 29, 2022
  • 15
  • 2021/2022
  • Summary

Subjects

  • hoofdstuk 3
  • dna technieken
  • zelfstudieodpracht
  • moleculaire biologie
  • professor van camp
  • universiteit antwerpen

Connected book

book image

Book Title:

Author(s):

  • Edition:
  • ISBN:
  • Edition:

Written for

  • Universiteit Antwerpen (UA)
  • Biomedische Wetenschappen
  • Moleculaire Biologie
All documents for this subject (86)

Seller

avatar-seller
VFua

Reviews received

Content preview

Hoofdstuk 3: DNA-technieken
1. DNA klonen
1.1 DNA klonen: fractioneren en zuiveren van DNA door cellen te transformeren met
recombinant-DNA
Het klonen van DNA in cellen  is een manier om DNA-sequenties te zuiveren
 Er kunnen grote hoeveelheden (vele identieke kopieën) van een DNA-sequentie worden
bereid, zodat de sequentie kan worden bestudeerd
 Betrokken cellen: vaak bacteriële + minder vaak gistcellen
 Fase 1 transformatie: cellen worden behandeld (cellen waarin men DNA-moleculen
gaat aanbrengen die men wil klonen)
 Fase 2: het te klonen DNA wordt covalent verbonden (geligeerd) met een vector-
DNA-sequentie  zal helpen bij replicatie in de gastcellen
o DNA-fragmenten + vectormoleculen= vorming van een kunstmatig
recombinant DNA
o kan lineair / circulair zijn
 lineair: bij DNA gisten
 circulair: bij DN A

Het transformatieproces is selectief
 Als vreemd DNA in een cel komt: meestal maar 1 DNA-molecule door cel opgenomen
 Als meerdere vreemde DNA-fragmenten aanbieden aan celpopulatie: DNA-
fragmenten willekeurig toegewezen aan verschillende cellen
 celpopulatie is sorteerkantoor die vreemde DNA-fragmenten kan verdelen
 Celklonen ontstaan vanuit 1 getransformeerde cel

A) Amplificatie
Kloneringssystemen: mogelijk om grote hoeveelheden van gekloond DNA te maken
 ingebrachte DNA geamplificeerd tot zeer hoge kopie-aantallen
 Om twee redenen mogelijk:
1) 1 bacterie met gekloond DNA kan zich snel delen
 zo veel identieke klonen van bacteriecellen produceren
 hebben allemaal dezelfde vreemde DNA-sequentie
2) Sommige vectormoleculen kunnen zich binnen een bacteriecel repliceren tot vrij hoge
kopie-aantallen (gebeurt onafhankelijk van gastheer chromosoom)
 als er covalente binding is met vreemde DNA-sequentie, zal ook die binnen de cel
worden vermeerderd (vectoren hebben eigen replicatie-oorsprong)


B) Vectormoleculen
Om menselijk DNA te kunnen vermenigvuldigen in bacteriële cellen / gistcellen, hebben
DNA-moleculen een geschikte replicatieherkomst nodig
= een DNA-sequentie die de DNA-replicatie in dat celtype in gang zet
 die DNA-sequentie = repliconen

Klonen in bacteriën: extrachromosomale replicons gebruikt
 repliceren onafhankeliijk van bacteriële chromosoom
 2 nuttige bronnen: plasmiden + bacteriofagen
o Plasmiden= kleine cirkelvormige dubbelstrengs-DNA's die zich in sommige
gevallen tot hoge kopie-aantallen kunnen repliceren
(antibiotica resistentie genen komen veel terug op plasmiden)
1

, o Bacteriofagen= bacteriële virussen
klonen van zeer grote DNA-fragmenten in gist: chromosomale replicatieoorsprong
gebruikt

Wanneer is het een bruikbare kloneringsvector?
 oorspronkelijke plasmide, de bacteriofaag of een ander replicon moet genetisch
worden gemodificeerd
 zo efficiënt vreemd DNA aan kunnen koppelen
 en zo kunnen getransformeerde cellen gemakkelijk worden herkend

Naakt vector-DNA= vector bevat geen ander DNA

Klassen klonerende vectoren:

Vector Gastheercel Uitleg
Plasmide E. coli - onafhankelijke replicatie van GH
chromosoom
- kunnen hoge kopie- aantallen bereiken
- op grote schaal gebruikt voor het kloneren van kleine DNA-
fragmenten
Bacterieel kunstmatig E. coli - is een gewijzigde plasmidevector
chromosoom (BAC) - heeft strikte beperking van het kopiegetal  grote fragmenten
kunnen stabiel worden vermeerderd
Gist kunstmatig Saccharomyces recombinanten zijn kleine lineaire chromosomen die grotendeels
chromosoom (YAC) cerevisiae bestaan uit menselijk of ander vreemd DNA




C) Fysieke kloonscheiding
Fysieke kloonscheiding voor cellen die verschillende DNA-fragmenten hebben
opgenomen
 Berust op de vorming van fysisch gescheiden celkolonies
o Uitplaten van getransformeerde bacteriële cellen (uitplaten: cellen in
petrischaaltjes in agar)
o Goed getransformeerde cellen: groeien, vermenigvuldigen
 vormen van elkaar gescheiden celkolonies
 elke celkolonie: bestaat uit celklonen (identieke afstammende cellen)
 die afkomstig van 1 getransformeerde cel
 bevatten elk hetzelfde vreemde DNA-molecuul
o een goed gescheiden celkolonie kan fysiek worden geplukt + gebruikt om groei
op gang te brengen van een grote cultuur
 grotere celcultuur van identieke cellen met zelfde vreemd DNA-molecule
 resultaat: grote amplificatie van 1 enkele DNA-sequentie
o Daarna kan het gekloonde vreemde DNA uit de bacteriecellen worden gezuiverd

D) Het maken van recombinant DNA
Hoe recombinant DNA maken?
 Elk DNA-fragment covalent binden (geligeerd) door DNA-ligase aan een vector-DNA-
molecule  recombinant-DNA gevormd
o Eerst moet het nodige DNA en vector-DNA geprepareerd worden
 zodat goed kunnen samengevoegd worden
 Recombinant-DNA in een geschikte GHcel getransporteerd (bacteriecel / gistcel)

2

, Kleine DNA-fragmenten gebruiken voor kloning in cellen  Hoe?
 Heel lange nucleaire DNA-moleculen gefragmenteerd tot nog steeds vrij lange
fragmenten (met heterogene uiteinden)
 De lange fragmenten moeten nog kleiner gemaakt worden + meer uniforme
eindsequenties hebben ( door restrictie enzymen) om ligatie te vergemakkelijken

Recombinant-DNA-technologie: gebruik van restrictie-endonucleasen om het DNA op
bepaalde plaatsen door te knippen
 Hierdoor DNA knippen tot kleine fragmenten met uniforme eindsequenties
 hierdoor gemakkelijk door DNA-ligase kunnen worden samengevoegd tot
vectormoleculen

Restrictie-enzymen zijn op zelfde wijze afgesneden!!

Meeste recombinant-DNA's (DNA + vector) cirkelvormig, maar kunnen in GHcel na
klonatie ook lineaire vorm krijgen bv. bij gistcellen  "yeast artificial chromosome" (YAC)


E) Restrictie endonucleases
De natuurlijke rol van restrictie-endonucleasen: verdediging van de gastheercel:
Restrictie-endonucleasen= restrictienucleasen
 zijn een klasse bacteriële enzymen
 herkennen specifieke korte-sequentie-elementen in een dubbelstrengig
DNA-molecuul
 splitsen DNA op beide strengen (binnen de herkenningssequenties
(=restrictieplaats) of in de nabijheid ervan)
 doel (oorspr): bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers (bacteriofagen)
o resitrictie endonucleasen kunnen de binnendringende ziekteverwekker
uitschakelen door het DNA van de ziekteverwekker selectief in kleine
stukjes te knippen
 Bescherming eigen genoom: GHcel produceert DNA-methyltransferase dat zijn
eigen DNA methyleert  eigen DNA kan niet splitsen door restrictienucleasen

Restrictie nucleasen als moleculair genetische hulpmiddelen
Verschillende klassen van restrictienucleasen  type II bespreking
 gebruikt bij het manipuleren + analyseren van DNA
 herkennen korte sequentie-elementen die typisch palindromen zijn
(de 5ʹ→3ʹ-sequentie is op beide strengen gelijk bv. GAATTC wordt complementair
CTTAAG)
 splitsen DNA op beide strengen (binnen
herkenningssequenties (=restrictieplaats) of in
de nabijheid ervan)
 De splitsing: vaak op asymmetrische posities
binnen de twee strengen om fragmenten te
produceren met overhangende 5ʹ uiteinden of
overhangende 3ʹ uiteinden
 DNA en vectormolecuul op zelfde wijze
geknipt!!  zo gemakkelijk ligeren door DNA
ligase en recombinant DNA-moleculen gemaakt
3

,  Vectormoleculen bv. plasmiden bevatten restrictieplaatsen voor
restrictienucleasen
1.2 DNA-bibliotheken en de toepassingen en beperkingen van het klonen van DNA
Klonen gebruikt om DNA-bibliotheken te maken= verzamelingen van DNA-klonen die alle
soorten DNA-sequenties in een complex uitgangsmateriaal vertegenwoordigen

Een goede genomische DNA-bibliotheek zou zoveel verschillende DNA-klonen bevatten dat
er een goede kans is dat de bibliotheek zowat alle verschillende DNA-sequenties in het
genoom zou bevatten.

Alternatief: maken van een gen-gecentreerde DNA-bibliotheken
Er zijn ook DNA sequenties die niet coderen voor eiwitten, maar voor RNA  RNA kan niet
worden gekloond
 Men ging DNA-kopieën maken mbv DNA-polymerase
 Door omgekeerde transcriptase: enkelstrengig RNA-sjabloon kopiëren in een
complementaire DNA-kopie (cDNA)
 Als cDNA-streng gemaakt: oorspronkelijke RNA vernietigd door behandeling met
ribonuclease + de gekopieerde DNA-streng wordt gekopieerd om een
complementair DNA te maken, waardoor dubbelstrengs cDNA wordt gemaakt
 gebruikt om cDNA-bibliotheek te maken

Het bereik van DNA-klonen kan in een cDNA-bibliotheek variëren naargelang het cDNA
 omdat verschillende genen in verschillende celtypes tot expressie komen

Nadeel: het klonen van DNA kruipt veel tijd en moeite in


2. PCR (polymerase kettingreactie)
2.1 De grondbeginselen van de polymerasekettingreactie (PCR)
PCR= een celvrije methode voor de amplificatie van DNA
 PCR is snel + maakt parallelle amplificatie mogelijk van DNA-sequenties uit meerdere
DNA-monsters
 Gebruik van hittestabiel DNA-polymerase om kopieën te synthetiseren van een klein
vooraf bepaald DNA-segment
 Voor de synthese van een nieuwe DNA-streng: DNA-polymerase heeft een
enkelstrengs oligonucleotideprimer nodig
 bindt aan een specifieke complementaire sequentie binnen het start-DNA.
o Is een kort enkelstrengig DNA of RNA stukje
o Oligonucleotiden +- 20 nucleotiden lang of meer
o Moet complementair zijn aan doelsequentie

Proces:
1) Denaturatie:
 DNA strengen van elkaar gescheiden door verwarming tot 95°C
 Waterstofbruggen verbroken
2) Hybridisatie
 De 2 DNA-primers (oligonucleotide) binden aan enkelstrengig deel DNA
 2 primers want 1 binden voor elk enkelstrengig DNA
 40°C- 60°C
3) Proliferatie/DNA-synthese:
 Taq DNA polymerase bouwt complementaire nucleotide in op
4

The benefits of buying summaries with Stuvia:

Guaranteed quality through customer reviews

Guaranteed quality through customer reviews

Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.

Quick and easy check-out

Quick and easy check-out

You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.

Focus on what matters

Focus on what matters

Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!

Frequently asked questions

What do I get when I buy this document?

You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.

Satisfaction guarantee: how does it work?

Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.

Who am I buying these notes from?

Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller VFua. Stuvia facilitates payment to the seller.

Will I be stuck with a subscription?

No, you only buy these notes for $4.30. You're not tied to anything after your purchase.

Can Stuvia be trusted?

4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)

69252 documents were sold in the last 30 days

Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 15 years now

Start selling
$4.30  1x  sold
  • (0)
Add to cart
Added