Inhoudsopgave
BAT2 – les 1 Sampling..........................................................................................................................................1
BAT2 – les 2 Extractietechnieken 1......................................................................................................................4
BAT2 – les 3 Extractie 2/ Immunocapture/ Highresolution MS...........................................................................7
BAT2 – les 4 Bioanalyse van kleine moleculen.....................................................................................................9
BAT2 – les 5 LC-MS based bioanalysis of proteins (grote moleculen)................................................................12
BAT2 – les 6 PK and PD (ELISA)..........................................................................................................................16
BAT2 – les 7 ADA................................................................................................................................................19
BAT2 – les 8 Biomarkers.....................................................................................................................................23
BAT2 – les 1 Sampling
Goede bioanalyse begint met een goede sample afname
- Het monster moet representatief zijn voor wat het was
Matrices:
- Bloed
- Plasma/serum
- Urine
Nog meer, bijv.: feces, CSF, sputum, semen, beenmerg, haar etc.
Dieren: weefsel/organen (kijken wat het effect hierop is)
Bloed
- Venapunctie
- 3-10 ml per afname
Plasma met anti-coagulant
Serum geen anti-coagulant serum minder eiwitten (die zijn
gestold), makkelijker voor het meten van andere eiwitten
Anti-coagulantia
EDTA, oxalate, citrate, heparine
EDTA
- Stopt de stolling
- Vormt complex met calcium, optimale concentratie 1,5 mg/ml
- Produceert minder stolsels in plasma dan heparine
- NA en K, K wordt meer gebruikt (beter oplosbaar in bloed)
- K2 EDTA en K3 EDTA veel gebruikt in de praktijk
- K2 EDTA kan worden droog gesprayd in buis – geen verdunning
Heparine
- Remt de stolling (vertraagt)
- Heterogene mix van moleculen, MW 12-15 kDa
- Optimale concentratie 0,2 mg/ml bloed
- Na en Li zouten beschikbaar
,Plasma: centrifugeren binnen 1 of 2 uur
Effect van bloedcellen op plasmaconcentratie
- Veel medicijnen verdelen zich tussen plasma en bloedcellen
- BPR (bloed plasma ratio) = concentratie geneesmiddel in bloed/ concentratie
geneesmiddel in plasma
Geneesmiddel alleen in plasma, niet in cellen, BPR = 0,5
Geneesmiddel verdeelt over plasma en cellen, BPR = 1
Geneesmiddel alleen in cellen, niet in plasma, BPR = >>1
Consequenties:
- Verdeling tussen plasma en bloedcellen is temperatuur afhankelijk
- Temperatuur lichaam is 37 graden
- Na afname verandert dit, evenwicht verschuift (medicijn moleculen kunnen door
temperatuursverandering (bijv. ijs) in of uit de bloedcellen bewegen)
- BPR kan veranderen (dit wil je niet)
- Je moet ervoor zorgen dat de plasmaconcentratie niet verandert
Urine
Interval urine afname: 0-2 uur of 24-48 uur na dosering
- Aan het eind van 24 uur een deelmonster
- Urine kan tot 24 uur worden bewaard voordat er een deelmonster wordt
uitgenomen
Totaal per dag: 1-3 liter
Urine opslag bij 4 graden
- Oplosbaarheid veranderd, geneesmiddelen lossen niet goed op in water
- Geneesmiddel gaat aan de binnenkant zitten van het plastic
- Concentratie is dan anders
Oplossing: buis uit container steeds overgooien in schone buizen, steeds concentratie meten
(als er uiteindelijk niks meer te meten is, heb je last van adsorptie)
(als de concentratie hetzelfde blijft is er niks aan de hand)
Detergens toevoegen om oplosbaarheid te verbeteren (bijv. tween-20)
Urine kan sediment veroorzaken (kristalliseren van zouten), na vries-dooi
Sommige geneesmiddelen gaan in het sediment zitten
- Oplossen: weer verwarmen naar 37 graden in een waterbad
- Of door te mixen (vortex)
Microsampling
Bloed (om het volume te verminderen)
- Dried blood spot (DBS) – vingerprik (hielprik), op een soort kaartje
- Volumetric absorptive microsampling (VAMS) – druppel bloed op een spons (spons
neemt een vast volume op)
, - Capillairy microsampling (CMS) – dun, hol buisje met een capillair en EDTA, kan ook
worden afgedraaid, dan plasma (zelfde als normaal, maar veel minder volume)
Voordelen:
- Besparen op proefdieren
- Minder pijnlijk
- Meerdere samples per proefdier i.p.v. meerdere proefdieren
- Studies met kleine kinderen of erg zieke mensen mogelijk
- Makkelijker uit te voeren in minder ontwikkelde landen (geen centrifuges etc. nodig)
DBS (Dried Blood Spot)
- Bloeddruppel wordt opgevangen op een speciaal type absorberend filtreerpapier
(opdrogen)
- Typische bloedvolumes: <100 µl per afname
Analyse:
- Kleine cirkel uit het papier “stansen”, 3 mm diameter
- In extractiemiddel – methanol (met interne standaard)
- Extract analyseren met LC-MS/MS
Voordeel:
- Transport en opslag kan bij kamertemperatuur
Nadeel:
- Bloed kan variëren per persoon in hematocriet (welke percentage van bloed wordt
ingenomen door bloedcellen)
- Hoe hoger het hematocriet, des te stroperiger het bloed blood spot wordt kleiner
(want het is minder visceus)
- Hoog hematocriet groter percentage van het oppervlak wanneer je hetzelfde
rondje stanst
- Geneesmiddel in bloed verdeelt zich niet homogeen over de blood spot
- Voor kalibratoren moet bloed afgenomen worden
- Resultaat van de concentratie is in bloed (want je maakt er geen plasma van maken)
- Meeste referentiewaarden (eerdere studies) zijn gemaakt in plasma
VAMS (Volumetric absorptive microsampling)
Hematocriet effect kan opgelost worden door een gefixeerd volume
- Sponsje kan bijvoorbeeld precies 10 µl absorberen (vaak 10-30µl)
- Sponsje wordt in een buisje geplaatst extractie
Voordeel:
- Zelfde als DBS, alleen geen last meer van hematocriet
Nadeel:
- Nog steeds bloed nodig voor controle
- Resultaat nog steeds in bloed
CMS (Capillaire microsampling)
- Analyse kan ook in plasma i.p.v. in bloed
- Bloed opgevangen in capillair (met antistollingsmiddel behandeld)
- <50 µl per sample
- Na centrifugatie kan het plasma worden bewaard en ingevroren
BAT2 – les 1 Sampling..........................................................................................................................................1
BAT2 – les 2 Extractietechnieken 1......................................................................................................................4
BAT2 – les 3 Extractie 2/ Immunocapture/ Highresolution MS...........................................................................7
BAT2 – les 4 Bioanalyse van kleine moleculen.....................................................................................................9
BAT2 – les 5 LC-MS based bioanalysis of proteins (grote moleculen)................................................................12
BAT2 – les 6 PK and PD (ELISA)..........................................................................................................................16
BAT2 – les 7 ADA................................................................................................................................................19
BAT2 – les 8 Biomarkers.....................................................................................................................................23
BAT2 – les 1 Sampling
Goede bioanalyse begint met een goede sample afname
- Het monster moet representatief zijn voor wat het was
Matrices:
- Bloed
- Plasma/serum
- Urine
Nog meer, bijv.: feces, CSF, sputum, semen, beenmerg, haar etc.
Dieren: weefsel/organen (kijken wat het effect hierop is)
Bloed
- Venapunctie
- 3-10 ml per afname
Plasma met anti-coagulant
Serum geen anti-coagulant serum minder eiwitten (die zijn
gestold), makkelijker voor het meten van andere eiwitten
Anti-coagulantia
EDTA, oxalate, citrate, heparine
EDTA
- Stopt de stolling
- Vormt complex met calcium, optimale concentratie 1,5 mg/ml
- Produceert minder stolsels in plasma dan heparine
- NA en K, K wordt meer gebruikt (beter oplosbaar in bloed)
- K2 EDTA en K3 EDTA veel gebruikt in de praktijk
- K2 EDTA kan worden droog gesprayd in buis – geen verdunning
Heparine
- Remt de stolling (vertraagt)
- Heterogene mix van moleculen, MW 12-15 kDa
- Optimale concentratie 0,2 mg/ml bloed
- Na en Li zouten beschikbaar
,Plasma: centrifugeren binnen 1 of 2 uur
Effect van bloedcellen op plasmaconcentratie
- Veel medicijnen verdelen zich tussen plasma en bloedcellen
- BPR (bloed plasma ratio) = concentratie geneesmiddel in bloed/ concentratie
geneesmiddel in plasma
Geneesmiddel alleen in plasma, niet in cellen, BPR = 0,5
Geneesmiddel verdeelt over plasma en cellen, BPR = 1
Geneesmiddel alleen in cellen, niet in plasma, BPR = >>1
Consequenties:
- Verdeling tussen plasma en bloedcellen is temperatuur afhankelijk
- Temperatuur lichaam is 37 graden
- Na afname verandert dit, evenwicht verschuift (medicijn moleculen kunnen door
temperatuursverandering (bijv. ijs) in of uit de bloedcellen bewegen)
- BPR kan veranderen (dit wil je niet)
- Je moet ervoor zorgen dat de plasmaconcentratie niet verandert
Urine
Interval urine afname: 0-2 uur of 24-48 uur na dosering
- Aan het eind van 24 uur een deelmonster
- Urine kan tot 24 uur worden bewaard voordat er een deelmonster wordt
uitgenomen
Totaal per dag: 1-3 liter
Urine opslag bij 4 graden
- Oplosbaarheid veranderd, geneesmiddelen lossen niet goed op in water
- Geneesmiddel gaat aan de binnenkant zitten van het plastic
- Concentratie is dan anders
Oplossing: buis uit container steeds overgooien in schone buizen, steeds concentratie meten
(als er uiteindelijk niks meer te meten is, heb je last van adsorptie)
(als de concentratie hetzelfde blijft is er niks aan de hand)
Detergens toevoegen om oplosbaarheid te verbeteren (bijv. tween-20)
Urine kan sediment veroorzaken (kristalliseren van zouten), na vries-dooi
Sommige geneesmiddelen gaan in het sediment zitten
- Oplossen: weer verwarmen naar 37 graden in een waterbad
- Of door te mixen (vortex)
Microsampling
Bloed (om het volume te verminderen)
- Dried blood spot (DBS) – vingerprik (hielprik), op een soort kaartje
- Volumetric absorptive microsampling (VAMS) – druppel bloed op een spons (spons
neemt een vast volume op)
, - Capillairy microsampling (CMS) – dun, hol buisje met een capillair en EDTA, kan ook
worden afgedraaid, dan plasma (zelfde als normaal, maar veel minder volume)
Voordelen:
- Besparen op proefdieren
- Minder pijnlijk
- Meerdere samples per proefdier i.p.v. meerdere proefdieren
- Studies met kleine kinderen of erg zieke mensen mogelijk
- Makkelijker uit te voeren in minder ontwikkelde landen (geen centrifuges etc. nodig)
DBS (Dried Blood Spot)
- Bloeddruppel wordt opgevangen op een speciaal type absorberend filtreerpapier
(opdrogen)
- Typische bloedvolumes: <100 µl per afname
Analyse:
- Kleine cirkel uit het papier “stansen”, 3 mm diameter
- In extractiemiddel – methanol (met interne standaard)
- Extract analyseren met LC-MS/MS
Voordeel:
- Transport en opslag kan bij kamertemperatuur
Nadeel:
- Bloed kan variëren per persoon in hematocriet (welke percentage van bloed wordt
ingenomen door bloedcellen)
- Hoe hoger het hematocriet, des te stroperiger het bloed blood spot wordt kleiner
(want het is minder visceus)
- Hoog hematocriet groter percentage van het oppervlak wanneer je hetzelfde
rondje stanst
- Geneesmiddel in bloed verdeelt zich niet homogeen over de blood spot
- Voor kalibratoren moet bloed afgenomen worden
- Resultaat van de concentratie is in bloed (want je maakt er geen plasma van maken)
- Meeste referentiewaarden (eerdere studies) zijn gemaakt in plasma
VAMS (Volumetric absorptive microsampling)
Hematocriet effect kan opgelost worden door een gefixeerd volume
- Sponsje kan bijvoorbeeld precies 10 µl absorberen (vaak 10-30µl)
- Sponsje wordt in een buisje geplaatst extractie
Voordeel:
- Zelfde als DBS, alleen geen last meer van hematocriet
Nadeel:
- Nog steeds bloed nodig voor controle
- Resultaat nog steeds in bloed
CMS (Capillaire microsampling)
- Analyse kan ook in plasma i.p.v. in bloed
- Bloed opgevangen in capillair (met antistollingsmiddel behandeld)
- <50 µl per sample
- Na centrifugatie kan het plasma worden bewaard en ingevroren
