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Apuntes Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
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Apuntes de biología molecular sobre las técnicas de PCR.
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las técnicas deP C R
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite
obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de
ADN molde. Aunque en un principio la PCR se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN presente
en una molécula mucho mayor, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido amplificar fragmentos de gran
tamaño (hasta 35 kb) y se han desarrollado diferentes variantes que permiten:
Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción → PCR múltiple
Amplificar fragmentos de ARN → RT-PCR (PCR inversa o de retrotranscripción)
Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra →
PCR cuantitativa, PCR a tiempo real
Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes frente a otras técnicas son:
Como técnica de amplificación: respecta a las técnicas de clonación en vectores mediante tecnología
de ADN recombinante, la PCR, supone un ahorro de tiempo (la PCR se hace en horas y la hibridación
en días), y además están completamente automatizadas mientras que la clonación es un proceso
manual.
Como técnica de detección: respecto a las técnicas de hibridación, la PCR requiere una cantidad de
muestra mucho menor y, además, permite la cuantificación de secuencias concretas (PCR en tiempo
real).
Además, su principal ventaja, la gran sensibilidad es también su mayor desventaja debido a la
contaminación; para minimizar la contaminación, son claves las medidas de prevención como el diseño
de los laboratorios, los procedimientos de trabajo y el flujo de las muestras.
, Actualmente, esta posibilidad de conseguir altos
niveles de amplificación en tiempos cortos y su mayor
sensibilidad de detección han convertido a la PCR en
la técnica básica de cualquier laboratorio de BM.
Sus aplicaciones son innumerables en todos los
campos de la biología, la medicina e incluso la
paleontología; algunos ejemplos son:
EL diagnóstico y pronóstico de ciertas
enfermedades
La evolución y respuesta a tratamientos
Los estudios de expresión génica
Mutagénesis
Estudios filogenéticos
Genotipado
Medicina forense…
La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN; este
diseño repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven
también de molde para sintetizar otras nuevas copias en los ciclos siguiente, produciéndose un aumento
exponencial en el nº de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que se realice.
La técnica fue ideada en 1983 por Kary Mullis.
Para conseguirlo, hay que solucionar 2 problemas:
Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el fragmento
que nos interesa estando este en una mezcla compleja de moléculas de ADN → solución: diseño de
cebadores específicos que permiten la amplificación exclusiva de una fragmento concreto de ADN.
Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la Tª elevada
necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde → solución: descubrimiento de las ADN
polimerasas termoestables.
Los cebadores o primers
Los cebadores o primers son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de la
regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar creando una región bicatenaria que sirve para la
unión de la ADN polimerasa. Estos se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario de una
secuencia adyacente a la región de interés, pero en extremos y cadenas opuestas:
El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´→ 5´ se denomina cebador F
o Forward.
El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´→ 3´ se denomina cebador R o reverse.
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