Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en genomics
1. DNA sequentiebepaling
Overzicht:
Toepassingen: De novo genoom sequentiebepaling, resequencing, sequentiebepaling als teller
1.1. Sanger sequencing = 1ste generatie sequentiebepaling
1.1.1. Maxam en gilbert: ter illustratie
Chemische klieving methode
1.1.2. Sanger sequencing = dideoxy-keten terminatiemethode
Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillend fluorescent label)
huidige methode: fluorescent gelabelde ddNTPs & scheiding door capillaire gelektroforese
1 streng per keer wordt afgelezen beperkt tot +/- 500 nt, moeite met herhalingen
Juiste verhouding dNTPs en ddNTPs nodig
Voor betrouwbaarheid: best 2 aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
resultaat = elektroferogram
Elektroferogram aflezen na insertie/deletie: sequentie wordt gemengd (want bulk sequencing) geen
onderscheid mogelijk (nadeel van bulk: mutatiedetectie) <-> kwaliteitsscore = hoe zeker je bent dat er wel
een nucleotide is ingebouwd (per positie: letter & score)
Kwaliteitsscores Phred score Q = -10log10(P) met P = probabiliteit van foutieve base call bv Q = 30 = kans
van 1 op 1000 dat de call foutief is = 99,9% zekerheid
(Phred score = negatieve log vd kans dat de base call foutief is)
HGP nieuwe uitdagingen: volledige seq (telomeer tot telomeer), meerdere species sequencen, meer
individuele humane sequenties, persoonlijke genoomsequentie van iedereen.
HGP veel opties voor “precision medicine”: diagnose, prognose, preventie (kennis van DNA volgorde en
SNPs); farmacogenomics; therapie op maat, ethische aspecten
1
, 1.2. Short-read next-generation sequencing = 2de generatie sequentiebepaling
Doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling
Voordelen: heel snel, goedkoper vergeleken met vroeger, 85-99,9% accuraatheid (Phred = 30), weinig DNA
template als input nodig
Nadelen: beperkte read lengte van 35-700 bp (niet geschikt voor de novo sequencing), door throughput
grote absolute hoeveelheid fouten zorgvuldige inspectie
3 soorten sequencing: WGS, WES (1,5% van het genoom) en targeted sequencing
Ontwikkeling van nieuwe technologieën van 2nd generation is gebaseerd op:
parallelle detectie (massive parallel sequencing)
miniaturisatie van reacties
integratie van het proces (directe detectie) (<-> scheiding via gelelektroforese)
4 stappen: aanmaak DNA library klonale in vitro amplificatie sequentiebepaling data analyse
Stap 1: aanmaak NGS DNA library
- Soorten DNA library: WGS, WES of targeted sequencing (aanrijking door hybridisatie aan probes),
amplicon sequencing (PCR amplicons) library: min. bias en voldoende complexiteit
- 1.0 voorbereiding kwaliteitscontrole van het input DNA en evt poolen van libraries (multiplexen)
o Hoeveelheid en concentratie bv spectrofotometrie, fluorometrie, elektroforese, …
o Zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
o Integriteit bv capillaire elektroforese met bio-analyzer kijken of het DNA intact is
- 1.1 Fragmentatie en evt target aanrijking (enrichment bv exonen eruit halen bij WES)
verschillende methoden vragen verschillende fragmentlengte (inserts)
o Fysisch: nebulizatie, sonicatie, acoustic shearing (ultrasone geluidsgolven, zijn heel gericht)
o Enzymatisch: DNAse1, fragmentase
- 1.2 End repair en ligatie adapters (aanhechten)
o Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment 5’3’ polymerase en 3’5’
exonuclease)
o 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
o Evt 3’ non-template A (Taq polymerase)
o Ligatie met fragment uiteinden (mbv sticky end met 3’A overhang of mbv blunt end)
o Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren
o Adapters= sequencing primers + evt barcodes (per staal/molecule)
tagmentatie (in een Illumina kit) = fragmentatie en adapters aanhechten in 1 stap:
transposase enzym met dubbele activiteit (knipt en voegt adapters toe)
- 1.3 Size selection (voor of na adapter ligatie) 2 opties:
o Klassiek: Via agarose gel-elektroforese (gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met
alcoholprecipitatie of ionenuitwisselingskolom
o Via magnetische beads, bindt DNA (van bepaalde lengte), verhouding DNA/beads bepaald
gebonden lengte
Stap 2: klonale in vitro amplificatie 3 ≠ methoden om scheiding tss clusters te behouden:
- in vitro: solid-phase bridge amplificatie: aanhechting aan oligonucleotiden op vast opp +
amplificatie (clusters = polonies: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule op een 1-2 µm spot)
- emulsie: aanhechting aan oligonucleotiden op beads + amplificatie in emulsie
(clusters: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule gebonden op een bead)
- rolling-circle amplificatie in oplossing: circulaire DNA template geamplificeerd (clusters = nanoballs
= concatemeren: lange DNA molecule met meerdere kopieën van template na elkaar)
2
1. DNA sequentiebepaling
Overzicht:
Toepassingen: De novo genoom sequentiebepaling, resequencing, sequentiebepaling als teller
1.1. Sanger sequencing = 1ste generatie sequentiebepaling
1.1.1. Maxam en gilbert: ter illustratie
Chemische klieving methode
1.1.2. Sanger sequencing = dideoxy-keten terminatiemethode
Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillend fluorescent label)
huidige methode: fluorescent gelabelde ddNTPs & scheiding door capillaire gelektroforese
1 streng per keer wordt afgelezen beperkt tot +/- 500 nt, moeite met herhalingen
Juiste verhouding dNTPs en ddNTPs nodig
Voor betrouwbaarheid: best 2 aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
resultaat = elektroferogram
Elektroferogram aflezen na insertie/deletie: sequentie wordt gemengd (want bulk sequencing) geen
onderscheid mogelijk (nadeel van bulk: mutatiedetectie) <-> kwaliteitsscore = hoe zeker je bent dat er wel
een nucleotide is ingebouwd (per positie: letter & score)
Kwaliteitsscores Phred score Q = -10log10(P) met P = probabiliteit van foutieve base call bv Q = 30 = kans
van 1 op 1000 dat de call foutief is = 99,9% zekerheid
(Phred score = negatieve log vd kans dat de base call foutief is)
HGP nieuwe uitdagingen: volledige seq (telomeer tot telomeer), meerdere species sequencen, meer
individuele humane sequenties, persoonlijke genoomsequentie van iedereen.
HGP veel opties voor “precision medicine”: diagnose, prognose, preventie (kennis van DNA volgorde en
SNPs); farmacogenomics; therapie op maat, ethische aspecten
1
, 1.2. Short-read next-generation sequencing = 2de generatie sequentiebepaling
Doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling
Voordelen: heel snel, goedkoper vergeleken met vroeger, 85-99,9% accuraatheid (Phred = 30), weinig DNA
template als input nodig
Nadelen: beperkte read lengte van 35-700 bp (niet geschikt voor de novo sequencing), door throughput
grote absolute hoeveelheid fouten zorgvuldige inspectie
3 soorten sequencing: WGS, WES (1,5% van het genoom) en targeted sequencing
Ontwikkeling van nieuwe technologieën van 2nd generation is gebaseerd op:
parallelle detectie (massive parallel sequencing)
miniaturisatie van reacties
integratie van het proces (directe detectie) (<-> scheiding via gelelektroforese)
4 stappen: aanmaak DNA library klonale in vitro amplificatie sequentiebepaling data analyse
Stap 1: aanmaak NGS DNA library
- Soorten DNA library: WGS, WES of targeted sequencing (aanrijking door hybridisatie aan probes),
amplicon sequencing (PCR amplicons) library: min. bias en voldoende complexiteit
- 1.0 voorbereiding kwaliteitscontrole van het input DNA en evt poolen van libraries (multiplexen)
o Hoeveelheid en concentratie bv spectrofotometrie, fluorometrie, elektroforese, …
o Zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
o Integriteit bv capillaire elektroforese met bio-analyzer kijken of het DNA intact is
- 1.1 Fragmentatie en evt target aanrijking (enrichment bv exonen eruit halen bij WES)
verschillende methoden vragen verschillende fragmentlengte (inserts)
o Fysisch: nebulizatie, sonicatie, acoustic shearing (ultrasone geluidsgolven, zijn heel gericht)
o Enzymatisch: DNAse1, fragmentase
- 1.2 End repair en ligatie adapters (aanhechten)
o Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment 5’3’ polymerase en 3’5’
exonuclease)
o 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
o Evt 3’ non-template A (Taq polymerase)
o Ligatie met fragment uiteinden (mbv sticky end met 3’A overhang of mbv blunt end)
o Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren
o Adapters= sequencing primers + evt barcodes (per staal/molecule)
tagmentatie (in een Illumina kit) = fragmentatie en adapters aanhechten in 1 stap:
transposase enzym met dubbele activiteit (knipt en voegt adapters toe)
- 1.3 Size selection (voor of na adapter ligatie) 2 opties:
o Klassiek: Via agarose gel-elektroforese (gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met
alcoholprecipitatie of ionenuitwisselingskolom
o Via magnetische beads, bindt DNA (van bepaalde lengte), verhouding DNA/beads bepaald
gebonden lengte
Stap 2: klonale in vitro amplificatie 3 ≠ methoden om scheiding tss clusters te behouden:
- in vitro: solid-phase bridge amplificatie: aanhechting aan oligonucleotiden op vast opp +
amplificatie (clusters = polonies: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule op een 1-2 µm spot)
- emulsie: aanhechting aan oligonucleotiden op beads + amplificatie in emulsie
(clusters: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule gebonden op een bead)
- rolling-circle amplificatie in oplossing: circulaire DNA template geamplificeerd (clusters = nanoballs
= concatemeren: lange DNA molecule met meerdere kopieën van template na elkaar)
2
