ZEER uitgebreide cursus die ik zelf heb opgesteld omdat ik nood had aan een ordelijke en uitgebreide cursus om methoden 3 te kunnen studeren.
In dit document staat de informatie vanop de slides gecombineerd met de mondelinge uitleg die werd gegeven tijdens de hoorcolleges.
Genexpressie moduleren op verschillende niveaus (DNA wijzigen, inwerken op RNA of rechtstreeks
inwerken op het eiwit om deze af te breken) doel:
Functie en rol van eiwitten in fysiologie en pathologie bestuderen (bv in een ziektebeeld)
Doelwitten (eiwitten of genen) identificeren voor ontwikkelen van medicijnen die functie van
genproducten moduleren
Overzicht:
1. Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie
Principe:
Gebaseerd op Watson-Crick base paring met mRNA sequentie (hybridisatie met DNA/RNA)
zuiver en specifiek
Twee verschillende methodologiën:
o ASO: AntiSense Oligonucleotiden single strand oligo
o RNAi: RNA interferentie
1.1. Antisense oligonucleotiden (ASO) (ssDNA)
Kort (8-50nt) enkelstrengig DNA (ssDNA)
Gericht tegen mRNA van gen waarvan men expressie wil down moduleren (inhiberen)
Basis: Vorming van stabiel RNA/DNA duplex
Resultaat: Onderdrukking/modulering van genexpressie via 3 complementaire mechanismen:
o Dus 3 mechanismen en 2 methoden
o Approach 1:
Pre-mRNA = mRNA in de nucleus sequentie richten naar het poly-A-signaal van het
specifieke gen of tegen splicing acceptor sites
Poly-A: pre-mRNA heft geen poly-A degradatie
Splicing: exonen overslaan (om ziektebeeld bv op te lossen) degradatie
Vb van therapie: eteplirsen: gericht tegen DMD gen dat codeert voor dystrofine
o Approach 2 : op niveau van mature mRNA:
(a) RNase-H-afhankelijke target mRNA degradatie (vb fomivirsen – CMV retinitis)
(afbraak tot gevolgd) (DUS: oligo tegen mRNA hybride afbraak door RNase H)
74
, (b) blockage van ribosome binding site, 5’ cap site, translatie initiatie site (geen
translatie tot gevolg) (DUS: Oligo richten tegen functionele domeinen bv 5’ cap ook
geen vertaling naar eiwit
Barrières voor toepassing van de oligo’s:
Opname in de cel en
weefseldistributie (wordt niet
gemakkelijk opgenomen)
o betere opname door:
o Chemische modificaties bv
cholesterol aanhangen om
opname te verhogen of
fusioneren met een cell-
penetrating peptide
o Inkapselen in nanopartikels
Stabiliteit: afbraak door nucleases
(kunnen gemakkelijk hun activiteit
verliezen)
o Chemische modificaties: in
fosfaatgroep, suiker, base
stabieler maken
Toxiciteit
Dus 3 nadelen: zorgen dat ze in de cel
geraken, snelle afbraak in de cel, toxisch
1.2. RNAi = RNA interface
RNA interferentie is het proces waarbij de expressie van een doelwitgen onderdrukt wordt door de
selectieve inactivatie van het mRNA door dsRNA
dsRNA wordt geprocessed tot ssRNA dat dan kan base-paren met het doelwit mRNA (ssRNA is dan
complementair met het doelwit)
Gebruik maken van proces dat reeds natuurlijk voorkomt in cellen (zie ook miRNA)
2 methoden voor RNAi technologie:
Mechanisme van RNA Interferentie
A. Endogene miRNA silencing pathway (doel: genexpressie gericht moduleren)
a. In cytoplasma wordt het pre-miRNA herkend door het nuclease dicercomplex knipt het pre-
miRNA in een dsRNA van ongeveer 20-22 nucleotiden
b. Dit dsRNA wordt herkend door het RISC-complex en AGO2 (RNA Induced Silencing Complex en
AGO2 = arganaut is een soort RNase)
c. 1 van de 2 strands wordt afgebroken (= passenger strand), daarna vormt zich een complex van
ssRNA (guide strand) met het RISC- en AGO2 complex
d. Dit ssRNA gaat complementair zijn met stukken van het mRNA en hiermee hybridiseren
eiwitcomplex zit nu op het mRNA
e. translatie van het mRNA wordt hierdoor geblokkeerd
f. Note: de 1ste 8 nt zijn belangrijk voor de hybridisatie, niet alle 20-22 hierdoor kan 1 miRNA
verschillende mRNA’s van verschillende genen gaan downreguleren
75
, B. 20 nucleotides van dsRNA gericht tegen een gen in de cel brengen
a. Zelfde proces als bij het miRNA
b. Optie 1: siRNA van 20 nt Dicer moet niet meer knippen
c. Optie 2: siRNA lander dan 20 nt Dicer knipt wel
d. Verschil met endogene pathway (miRNA): door specifieke design zorg je ervoor dat de 20
nucleotiden perfect matchen met het mRNA dat je wilt down reguleren
e. AGO2 gaat hierdoor het mRNA in 2 knippen <-> miRNA: translatie blokkeert degradatie
in P-bodies
A
B
siRNA:
Commercieel verkrijgbaar: custom of pre-
designed, al dan niet gevalideerd
(alternatief: in vitro transcriptie)
Accumuleren voornamelijk in cytoplasma
Knock-down van het RNA is transiënt
(gaat dus terug weg, daarna weer eiwitexpressie)
Delivery: verschillende methoden
Nadelen:
o Off-target effecten door interactie met natuurlijke miRNA pathways als de seed region (8 nt)
overeen komt met een andere mRNA miRNA effect kan dus ook andere mRNA’s / genen
downreguleren
o Immuunstimulatie = 2de off-target effect: patroon recognition receptoren in het aangeboren
immuunsysteem bv TLR gaan verschillende patronen herkennen TLR7 is hier van belang,
herkent dsRNA: voorkomen door minder G en U’s in de sequentie te steken
o Stabiliteit: onderhevig aan afbraak door nucleases
Oplossingen verminderen van de off-target effecten:
o Chemische modificaties van siRNA om ze stabieler te maken (in fosfaatgroep, ribose of base)
Single streng overhangs zijn gevoelig voor degradatie fosfothiodaat backbone
gebruiken
Methoxy op de 2’ vd base zorgt voor zowel minder immuunstimulatie als minder
off-target effecten
76
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller leenhaegemans. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $9.25. You're not tied to anything after your purchase.
