Summary
TIP!Samenvatting van de principes Lambda, PCR, elektroforese en restrictie enzymen
- Course
- Institution
Samenvatting van de principes Lambda, PCR, elektroforese en restrictie enzymen
[Show more]
Seller
Follow
silke10
Reviews received
Content preview
Lambda-PCREen PCR is een techniek die overeenkomt met de DNA-replicatie in een cel. Deze
techniek vindt alleen niet plaats in een cel, maar in een reageerbuisje waarin enkele
DNA-moleculen vermenigvuldigd worden. Net als in een cel zijn er bepaalde
ingrediënten nodig om een PCR-reactie te kunnen laten plaatsvinden. Een PCR-
reactiemix bevat naast het DNA, ook 2 primers, nucleotiden, een PCR-buffer en
DNA-polymerase. Dit is een enzym dat een base plakt aan de complementaire base.
Het enzym moet thermostabiel zijn, omdat het intact moet blijven tijdens het
denatureren, waarbij de temperatuur oploopt tot ongeveer 95°C. Vaak wordt
daarom Taq-DNA-polymerase gebruikt, dit enzym is afkomstig van een bacterie die
in een heetwaterbon leeft. De bacterie en dus de enzymen zijn dan ook bestand
tegen hoge temperaturen.
Een PCR-buffer is nodig om het DNA-polymerase zo goed mogelijk te laten werken.
De buffers bevatten vaak Mg2+-ionen, omdat DNA-polymerase dit als cofactor nodig
heeft om te functioneren. Zonder de ionen kan er geen vermeerdering van DNA
plaatsvinden. Verder bevatten de buffers ook pH-regelaars, ook dit is voor het DNA-
polymerase enzym, bij een optimale pH werkt deze het beste.
Zoals eerder genoemd is, bevat een PCR-reactiemix ook 2 primers, een forward en
reverse primer. Dit zijn kleine stukken enkelstrengs-DNA die binden aan het DNA
wat gedenatureerd is. De primers zijn de start van de DNA-synthese. De forward
primer bindt aan de niet coderende streng en de reverse primer aan de coderende
streng.
DNA is opgebouwd uit nucleotiden, deze zijn dus ook nodig bij een PCR. De
nucleotiden worden ook wel dNTP’s genoemd. Er zijn 4 soorten; Adenine, Cytosine,
Guanine en Thymine. In de PCR-mix moet de concentratie aan nucleotiden niet te
hoog of te laag zijn. Een te hoge concentratie kan ervoor zorgen dat het DNA-
polymerase dan de verkeerde nucleotiden inbouwt. Een te lage concentratie zorgt
ervoor dat de DNA-synthese in snelheid afneemt.
De PCR-cyclus heeft meerdere fases. Voordat het DNA vermenigvuldigt kan worden
moet het eerst gedenatureerd worden. Dit houdt in dat het dubbelstrengs DNA
zodanig wordt verhit dat de waterstofbruggen worden verbroken en het DNA uit
elkaar valt tot 2 enkelstrengs DNA-moleculen. De temperatuur waarbij dit
plaatsvindt is ongeveer 95°C. Deze temperatuur kan wat verschillen, dat ligt aan of
je werkt met kaal, gezuiverd DNA of met ruw, ongezuiverd DNA.
Nadat het dubbelstrengs DNA uit elkaar is gevallen breekt er een nieuwe fase aan.
Dit is de annaelingsfase. In deze fase wordt de temperatuur verlaagd tot ongeveer
50 graden en zal de forward en reverse primer binden aan de 2 enkelstrengs DNA-
moleculen.
, Wanneer dit is gebeurd, breekt de extensiefase aan. De temperatuur wordt weer
verhoogd tot 72 graden, bij deze temperatuur verloopt de DNA-synthese het beste.
De primers worden verlengd in de 5’- naar 3’-richting. Deze 3 fases worden elke
keer herhaalt totdat er 30 tot 40 cycli geweest zijn. Dan wordt er bijna geen DNA
meer gemaakt. De plateaufase breekt dan aan. Wanneer er toch meer PCR-cycli
nog plaatsvinden ontstaan er ongewenste producten, zoals primer-dimers.
Met de PCR-techniek kun je deze veel DNA-moleculen maken. Deze kunnen
vervolgens onderzocht worden. Toepassingen van de techniek zijn bijvoorbeeld het
maken van daderprofielen bij een forensisch onderzoek, waarbij kleine
hoeveelheden DNA van bijvoorbeeld haren of huidcellen worden vermeerderd met
een PCR. Verder kan je hele kleine hoeveelheden DNA bij een infectie aantonen of
om erfelijke ziektes te analyseren. Wij hebben in de praktijk de gevoeligheid
bepaald van de PCR-techniek met het DNA van het lambda-virus. Dit is een virus
dat leeft in en op E.coli. Tijdens de praktijk hebben we het DNA verdunt en bekeken
bij welke hoeveelheid DNA er nog een signaal zichtbaar was.
GEE presentatie
1.1 t/m 1.4, 3.1 t/m 3.2.4, 4.1 tot 4.4.1, 4.5, 4.6, 5.1 en 7.1. Deze stof wordt
getoetst.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller silke10. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.53. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
73243 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now