Summary
Samenvatting TIP! Hoorcolleges MBT 1 tm 6
- Course
- Institution
Samenvatting van de hoorcolleges 1 tm 6 van MBT. HC9 tm 12 ook te koop
[Show more]
Seller
Follow
silke10
Reviews received
Content preview
MBT TENTAMEN HOORCOLLEGESInhoud
Table of Contents
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen......................................................................................1
Informatie over de PCR techniek en het ontwerpen van primers................................................................7
Hoorcollege 3 Kloneren, kennisclips controleren, in frame, oriëntatie.....................................................11
Hoorcollege 4 Transfecteren en transformeren........................................................................................18
Hoorcollege 6 Real-time qPCR...................................................................................................................23
MBT WC6 HC5 DNA/RNA isolatie..............................................................................................................31
MBT WC8 HC7 Sequencen.........................................................................................................................36
MBT WC2 HC en kennisclips
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen
,Overzicht
- DNA replicatie
- PCR
- Primers
- Primers ontwerpen
- Polymerase
- DNA template
Wat doet een PCR?
Vermeerderd/amplificeert een specifiek stuk DNA
Toepassingen
- Gen of promotor kopiëren om te kloneren
- Mensen, dieren en virussen identificeren
- Aanwezigheid specifieke DNA sequentie aantonen
- Aantonen van genetische ziekten
- Identificeren van bacteriële infectie
Waarop is PCR techniek gebaseerd?
DNA replicatie
- Helicase zorgt ervoor dat twee strengen uit elkaar gaan
- Primers worden gemaakt door primase, maakt RNA primers op
willekeurige plekken aan primer bindt polymerase om DNA
te kopiëren
o DNA polymerase beweegt over DNA van 3’naar 5’
o DNA polymerase maakt nieuwe DNA van 5’naar 3’
Waarmee maak je een PCR reactie specifiek?
Door primers te ontwerpen en te bestellen artificiële DNA primers (oligo’s)
Benodigheden PCR
- PCR machine
- PCR reactievaatjes
, - PCR reactiemengel
o DNA (template)
o 2 primers (forward en reverse)
o Nucleotiden
o Taq polymerase hittestabiel, geen proofreading activiteit
Proofreading een polymerase die zijn eigen fouten hersteld/fouten uit DNA
streng haalt
o Buffer
- Analyse systeem: bijv agarose gel
PCR hoe werkt het?
1 Cyclus
1. Denaturatie (uitsmelten) 96 graden
2. Annealing (hybridisatie/plakken primer) 50-65 graden
3. Extensie (elongatie/maken DNA door polymerase) 72 graden met Taq Polymerase*
*in een cel is de temperatuur 37 graden met polymerase (Polα, Polδ, Polɛ)
Na n cycli heb je 2n keer zoveel materiaal
- Tussen elke stap detectie fluorescentie
Ontwerpen van primers
Primers
- Korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nucleotiden)
- Andere naam: oligo’s
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie is te maken
- Specifiek
Algemene regels voor design primers
, - 3’-end moet G of C zijn (sterke binding 3 H-bruggen, polymerase bindt beter)
- 17-28 baseparen
- 40-60% GC
- Primer dimeren voorkomen (primers zitten aan elkaar)
- Voorkom interne “self-annealing’
- Tm tussen 55 en 70 graden
o Tm = gemiddelde temperatuur waarin helft primers binden, 50% bindt nog aan target
sequentie
o Tm bereken voor 15-25 basen:
Tm= 2(A+T) + 4(C+G)
(A, T, C, G aantal van deze basen)
Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Te lage annealingstemperatuur a-specifieke PCR producten en/of meerdere PCR producten
- Temperatuur niet hoog genoeg waardoor verschillende basen niet ontkoppeld worden
Verschillende tijden voor amplificatie DNA
- Hoe groter het PCR product, hoe langer het duurt
- Sommige polymerases zijn langzaam
- Sommige stukken DNA zijn moeilijk te amplificeren (zeldzaam)
Taq DNA polymerase heeft geen proofreading. Pwo en Pfu DNA polymerases hebben wel proofreading
activiteit. Polymerases worden geïsoleerd uit archeabacteria. Door proofreading wordt activiteit
langzamer, maar wel met minder fouten.
Voorwaarde template DNA
- Meestal wordt DNA gezuiverd
- Geen remmers van DNA polymerase
o Bijvoorbeeld heemgroep in hemoglobine, humuszuur in aarde
- Target bereikbaar voor primers en Taq
- Geen EDTA (of hele lage concentratie): Mg2+
- Niet teveel fragmentatie/afbraak
- Niet te vaak vriezen/ontdooien
Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën (ook tijdens de opzuivering en analyse)
Kennisclip primer ontwerp met de hand
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller silke10. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.47. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67096 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now