Summary
Samenvatting H4: eiwitten
- Course
- Institution
Deze samenvatting omvat alle noodzakelijke informatie op een gestructureerde manier van de powerpoint van hoofdstuk4, eiwitten. Heeft verduidelijking waar nodig.
[Show more]
Seller
Followcharlotteallaert1
Reviews received
Content preview
12.4.1: ISOLEREN VAN EIWITTEN Serine of threonine fosfatasen Natrium fluoride
Natrium pyrofosfaat
- starmateriaal homogeniseren → ruw eiwitlysaat
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
- samenstelling homogenisatiebuffer voor eiwit:
▪ Buffer: pH ▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer
▪ Zout: niet denatureert & oplost ▪ Bekomen van ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren via:
▪ Protease inhibitoren: niet afbreekt o chromatografie
▪ Fosfatase inhibitoren: fosforylaties geconserveerd blijven o Elektroforese
▪ Detergent: oplossen celmembraanReducerend agens: breken
disulfidebruggen
2.4.2: AANMAAK VAN EIWITTEN
a) protease inhibitoren:
- doel:
Protease familie Protease inhibitoren
Serineproteasen PMSF 1) Wetenschappelijk onderzoek
→ Als serine essentieel is voor katalytische activiteit Benzamidine 2) Farmaceutische industrie
aprotinine 3) Waspoederindustrie
Metalloproteasen EDTA ( binden aan 4) Voedingsindustrie
→metaalionen nodig voor katalytische activiteit metaalionen)
CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
Cysteïne proteasen Leupeptine
→cysteïne essentieel voor katalytische activiteit - Voordelen:
Aspartaat proteasen Pepstatine ▪ Synthese artificiële eiwitten
→aspartaat essentieel voor katalytische activiteit ▪ Geen problemen toxiciteit organismen
- Nadelen:
▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer ▪ duur
▪ Met of zonder EDTA ▪ Kleine #
▪ Per cyclus:
b) fosfatase inhibitoren: o Opbrengst verlagen extra AZ
Fosfatasefamilie Fosfatase inhibitoren o Enkel korte sequenties
o Toepassingen:
, 2
▪ Aanmaak peptiden voor antistoffen ▪ vaak koppelen aan in vitro transcriptie, translatie
▪ Aanmaak artificiële eiwitten ▪ toepassingen:
o karakteriseren van ORF
Synthese van eiwitten door koppelen van peptiden:
o structurele & functionele studies
* einde van peptide linker:
- reactieve groep
IN VIVO EXPRESSIE SYSTEMEN
- reageert enkel met carboxygroep van AZ
▪ expressie van recombinant eiwit komt:
* beschermingsgroepen reacties voorkomen: o na introductie recombinant DNA
= recombinante eiwitproductie
- groen ~ N terminus bescherming
▪ Gekozen organisme:
- rood ~ bescherming zijketens o Bepaalt keuze expressie van plasmide & sequentie
* vrijzittende aminogroep reactie carboxygroep 2e AZ
Codon optimisatie:
* alle AZ ingebouwd:
o Wat:
- klievingsreactie: eiwit losmaken van peptide linker
▪ aanpassen eiwitcoderende DNA sequentie
o waarom:
▪ hogere eiwitexpressie
ENZYMATISCHE SYNTHESE IN VITRO
o waar:
▪ gebruik van reticulocyt ▪ codons waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn
o immature RBC o voorbeeld arganine als codon:
o bevat ribosomen ▪ 22%: AGA human sequentie
o bevat AZ en E ▪ 1 %: AGA E. Coli
o heeft sterk eiwittranslatiemechanisme → E. coli weinig tRNA
o gespecialiseerde aanmaak → moeilijk uit arginine een eiwit bouwen
→ codon optimalisatie nodig
, 3
Transiënte eiwitproductie Stabiele eiwitproductie ▪ PTM:
Transfectie van DNA Transductie van DNA o Bepaald structuur & functionaliteit
= DNA integreert NIET in genoom gastheercel = DNA integreert WEL in genoom ▪ Aggregaten/ inclusion bodies:
Gastcel delen → recombinant verdund Subcultuur aanwezig = slecht gestructureerde eiwitten
Duur: enkele dagen Duur: maanden o Voordelen:
▪ Geen last toxiciteit voor bacterie
▪ Beschermd van proteolyse
▪ Zuiver & hoog geconcentreerd eiwit
IPTG inductie
▪ Laboratoriumschaal vs. Industriële schaal Lac repressor binden op T7.
Kleine volumes grotere volumes ( tanken)
Hierdoor geen transcriptie of
translatie.
Expressiesystemen IPTG bindt Lac repressor & neem
af T7. Hierdoor kan T7 RNA
1) Bacteriële expressiesystemen polymerase binden & translatie
▪ E. Coli: plaatsvinden
o vaak gebruikt
o Bacterie: kapot voor eiwitsecretatie
▪ Bacillus subtilis: Artificiële bacteriële ribosomen ( Ribo-T)
o Eiwitsecretie in medium
o Bacterie: niet kapot voor eiwitsecretatie ▪ Witte ribosoom:
o mRNA transleren voor eiwitaanmaak
▪ Gekleurde ribosoom:
o extra artificiële ribosoom
o Ribo-T: zet kleine & grote SE aan elkaar
o andere Shine-Dalgarno sequentie herkennen:
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller charlotteallaert1. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.85. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
66579 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now