Week 1: Pharmaceutical biotechnology & Recombinant DNA technology
1.2 Hoorcollege
De productie van biologische geneesmiddelen begint bij het klonen van recombinant DNA. Dit
gebeurt in bacteriën. Er wordt een plasmide gevormd met het DNA en dit wordt ingebracht in een
bacterie of eukaryote cel. De eiwitten worden dan geproduceerd. Na de productie vindt zuivering
plaats en daarna de formulering en de opslag.
Splicing = intronen (niet-coderende stukken) worden uit
het pre-mRNA geknipt, waarna alleen exonen
overblijven. Doordat splicing op meerdere manieren kan
plaatsvinden, wordt er bij biologische geneesmiddelen
voornamelijk gewerkt met mRNA.
Transcriptie start site = aan het eind van de promotor.
Translatie start site = bij startcodon.
De translatie vindt plaats door ribosomen in het cytoplasma. Sommige geproduceerde eiwitten zijn
nodig in de cel zelf en andere hebben hun werking buiten de cel. Deze eiwitten gaan eerst door het
ER en door het golgi, waarna ze d.m.v. vesicles naar buiten kunnen worden gebracht. Het ER en het
golgi hebben ook een belangrijke werking in de vouwing van eiwitten.
Bij de vouwing vinden er posttranslationele modificaties plaats. Dit zijn o.a. glycosylering (=binding
van een suiker aan meestal een N of een O in de aminozuurketen) en disulfide bindingen (=covalente
bindingen tussen S-atomen van 2 verschillende cysteïne moleculen).
Om het recombinant mRNA te klonen heb je plasmiden nodig, ook wel vectoren genoemd. Dit is
circulair DNA dat zich bevindt in bacteriën en het bevat instructies voor specifieke eiwitten. Om
ervoor te zorgen dat de bacteriën de plasmiden gaan amplificeren, is er
een ORI (origin of replication) aanwezig in de plasmide. Daarnaast bevindt
zich in de plasmide het gen van interesse met een promotor, een open
reading frame met een start- en een stopcodon, vaak een sequentie voor
een poly-a staart en er zit een resistentie gen in. Het resistentie gen maakt
de bacteriën resistent voor antibioticum, waardoor je kan selecteren
welke bacteriën het plasmide wel hebben opgenomen en welke niet.
Voor de productie van biologische geneesmiddelen is het coderende stukje mRNA nodig (tussen
start- en stopcodon). Om dit te krijgen wordt er humaan mRNA gepakt uit een cel (weefsel) die het
gewilde gen tot expressie brengt. Het mRNA wordt dan omgezet naar cDNA m.b.v. reverse
transcriptase. Je krijgt dan enkelstrengs DNA, die d.m.v. PCR kan worden geamplificeerd.
Je hebt dan alleen nog de coderende sequentie. Deze moet nog goed worden geplakt tussen de
promotor en de terminator. Het knippen en plakken vindt plaats met restrictie enzymen.
Werking PCR:
Het DNA wordt eerst gedenatureerd waardoor de 2 strengen los van elkaar komen. Hierna voeg je
primers toe en door polymerase toe te voegen worden de primer dan verlengd, waardoor de
strengen worden geamplificeerd. Je hebt dan dus het aantal strengen verdubbeld.
1.4 Introductie in farmaceutische biotechnologie
Vergeleken met de sterk geautomatiseerde productie van chemische medicijnen, die slechts een
paar dagen duurt, is de productie van therapeutische eiwitten een complex en nauwlettend
gecontroleerd proces dat enkele weken of zelfs maanden duurt.
1. Small scale growth Het proces begint met het ontdooien van een flesje cellen uit de celbank. De
cellen worden gemengd met het groeimedium, wat de cellen voedt en laat groeien en delen. Elke cel
produceert een kleine hoeveelheid van het specifieke therapeutische eiwit gedurende een periode
van weken, de cellen zullen zich vermenigvuldigen van enkele miljoenen tot meer dan 30 miljard.
2. Large scale growth De celpopulatie van miljarden cellen wordt overgebracht naar een vat
genaamd de bioreactor, dat voldoende ruimte biedt om de cellen verder te laten vermenigvuldigen.
Zodra ze de volledige capaciteit van die bioreactor hebben bereikt, verhuizen ze naar een grotere om
het groeiproces voort te zetten. Dit wordt verschillende keren herhaald totdat weken later er
voldoende cellen zijn om naar de uiteindelijke productiebioreactor te gaan, groot genoeg om
duizenden liters tegelijk te bevatten.
3. Productie en verzameling In de productiebioreactor (=laatste bioreactor) krijgen de cellen
regelmatig extra medium om de cellen te stimuleren om te blijven groeien en om het therapeutische
eiwit te blijven produceren. De inhoud van de bioreactor wordt regelmatig geoogst. Monsters van de
oplossing in de bioreactor worden genomen en getest om de groei en kwaliteit van de cellen te
volgen.
4. Zuivering de verzamelde oplossing bevat het therapeutische eiwit samen met andere eiwitten.
Het therapeutische eiwit wordt hieruit gefilterd.
5. Fill and finish.
Verschillen tussen kleine moleculen en biologische geneesmiddelen:
Er wordt gesproken van biosimilars i.p.v. generieken, omdat kopieën van biologische
geneesmiddelen niet altijd identiek zijn het originele geneesmiddel vanwege de complexiteit van de
actieve stof (het eiwit) en door de manier waarop ze worden geproduceerd. Verschillen in he
productieproces kunnen leiden tot kleine verschillen in de 3D structuur en/of porsttranslationele
modificaties van een eiwit, die kunnen bijdragen aan een ander farmacokinetisch of
farmacodynamisch profiel.
1.5 Opdrachten – DNA, RNA en eiwitten
Template strand van DNA dient als een template voor de transcriptie. Deze kant wordt dus
gekopieerd door RNA polymerase II. RNA polymerase leest de template strand in 3’ naar 5’ richting
en het synthetiseert de RNA strand in 5’ naar 3’ richting.
Coding strand van DNA de strand die tegenovergesteld is aan de template strand en die dezelfde
volgorde heeft als mRNA.
Een DNA sequentie bestaat uit een herhaling van 4 letters (basen): thymine,
adenine, cytosine en guanine. Een basenparing wordt gevormd d.m.v.
waterstofbruggen. Het basenpaar cytosine en guanine bindt sterker dan het
basenpaar adenine en thymine vanwege het feit dat dit paar één waterstofbrug
meer vormt tussen de basen.
Verschillen in structuur tussen DNA en RNA:
- DNA is dubbelstrengs en bevat T en deoxyribose.
- RNA is enkelstrengs en bevat U en ribose.
Processen in eukaryote cel:
- RNA synthese celkern.
- Eiwit synthese cytosol (door ribosomen).
- Eiwit glycosylering ER en golgi.
- RNA splicing celkern.
Wat verschillend is met een prokaryote cel is dat deze geen celkern heeft. De RNA- en eiwitsynthese
vinden dus beide tegelijk in het cytosol plaats. Er vindt geen splicing plaats en bijna geen
glycosylering. Als er wel glycosylering plaats vindt, is dit aan de buitenkant van het plasmamembraan,
ofwel het periplasma.
Functie promotor een DNA-sequentie, die bepaalt waar de transcriptie van een gen door RNA-
polymerase begint. De promotor ligt direct upstream (vlak voor) het af te lezen gen. RNA-polymerase
en de benodigde transcriptiefactoren kunnen binden aan de promotorsequentie en transcriptie
starten.
Soorten RNA:
- mRNA (messenger RNA) = voor de expressie van een eiwit (coderend).
- rRNA (ribosomaal RNA) = code belangrijk voor de structuur en functie van ribosomen. Een ribosoom
bestaat voor 60% uit rRNA en 40% uit eiwit.
- miRNA (micro RNA) = klein stukje, niet-coderend RNA die transcriptie en translatie reguleert. Het
bindt aan mRNA. Het zijn dus kleine stukjes RNA betrokken bij de regulatie van genen.
- tRNA (transfer RNA) = een fysische link tussen mRNA en de aminozuurvolgorde van eiwitten. Het is
een adapter molecuul dat bestaat uit RNA en is meestal tussen 76 en 90 nucleotiden lang.
N-linked glycosylering is belangrijk voor de functie van eiwitten. N is een aminozuur (asparagine).
Hieraan worden suikereenheden gekoppeld. Glycosylering speelt een belangrijke rol in het bepalen
van de eiwitstructuur, de functie en de stabiliteit. Therapeutische eiwitten die in een ander
organisme zijn gemaakt, kunnen afwijkende glycosylering hebben en
dat kan invloed hebben op de functie en de afweerreactie. Het is dus
belangrijk om hier rekening mee te houden.
- ORI (origin of replication) = de plek waar DNA replicatie begint. De specifieke structuur van
de ORI kan variëren van organisme tot organisme, maar ze hebben een aantal eigenschappen
gemeen. Zo bevinden zich in de ORI altijd veel AT (adenine thymine) herhalingen, omdat de
binding tussen deze basen minder sterk is. Hierdoor zijn ze makkelijker te scheiden.
- Promotor = bevindt zich voor de gensequentie. Transcriptiefactoren kunnen hier binden en
transcriptie door RNA-polymerase II initiëren.
- Enhancer = een korte regio van DNA dat kan worden gebonden door eiwitten (activators) om
de transcriptie van genen te stimuleren. Enhancers zijn cis-acting en liggen vaak voor of
achter de promotor.
- Signaalpeptide = een korte peptide die zich bevindt aan de N-terminus van de meeste nieuw
gesynthetiseerde eiwitten die bestemd zijn voor uitscheiding.
- Restrictie-enzym herkenningsplekken = een DNA-sequentie, meestal 4-8 pb lang, dat wordt
herkend en gebonden door een specifiek restrictie-enzym. Dit is nodig om een dubbel strand
cut te maken in DNA.
- Eiwit-tag = peptide sequenties die kunnen worden gebonden aan een recombinant eiwit
sequentie om makkelijke detectie en zuivering van de recombinante eiwitten te faciliteren.
- 5’ UTR = UTR is het deel dat buiten het startcodon en het stopcodon valt. 5’ UTR is de
untranslated region aan de 5’ kant van het mRNA. Het bevindt zich dus voor het startcodon.
- Kozak sequentie = een nucleïnezuur sequentie die functioneert als een eiwit translatie
initiatie punt. Het bevindt zich in mRNA.
- Startcodon = codon waar de translatie begint.
- Poly-A signaalsequentie = een poly-A staart (volgorde AAUAAA) wordt toegevoegd aan RNA
aan het eind van de transcriptie. Hierdoor wordt mRNA beschermt tegen enzymatische
afbraak in het cytoplasma, het helpt bij het transport van mRNA uit de nucleus en het helpt
bij translatie.
- Resistentie marker = Bacteriën die zijn onderworpen aan een procedure om vreemd DNA in
te voeren, worden gekweekt op een medium dat een antibioticum bevat, en de bacteriële
kolonies die kunnen groeien, hebben het geïntroduceerde genetische materiaal met succes
opgenomen en uitgedrukt.
- ORF (open reading frame) = het deel van het ‘reading frame’ dat kan worden getransleerd.
Dus het deel tussen het startcodon en het stopcodon.
Restrictie-enzymen:
Restrictie-enzymen hebben elk een eigen manier om DNA te knippen. EcoRI knipt bijvoorbeeld als
volgt:
Er zijn manieren om te knippen:
- in het midden blunt end.
- cleave 3’ off center 5’ overhang (sticky end).
- cleave 5’ off center 3’ overhang (sticky end).
Overhang refereert naar de sequentie die enkelstrengs overblijft na het knippen van de restrictie-
enzymen. Dit kan nog zwak aan elkaar zitten door waterstofbruggen. Bij een blunt end is er geen
overhang.
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller amvaw. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.87. You're not tied to anything after your purchase.