Summary
VOLLEDIGE samenvatting methoden in biomedisch onderzoek 3
- Course
- Institution
Alles van methoden 3 samengevat: alle hoofdstukken, geen slides meer nodig, alle info van slides en extra noties.
[Show more]
2 reviews
By: sarahvermoere • 10 months ago
mega-good again:)
By: lorevanlooke • 1 year ago
Seller
Follow
paulinebal
Reviews received
Content preview
Alles Methoden 3 (2022-2023)3.2 Analyse van DNA & genomics
→ bekijk 1.13 DNA (extraheren, bewaren, kwantificeren, in vitro aanmaak, manipuleren)
DNA sequentiebepaling
Evolutie: sequencen = volgorde DNA aflezen
Fist generation sequencing
→ Sanger, elektroforese (gel), cloneren (plasmiden – bacterie)
→ Humaan Genoom Project: 10jaar voor genoom, veel wetenschappers & machines nodig
+: Gouden standaard kleine projecten
-: traag, veel wetenschappers & machines nodig, duur
Second generation sequencing (= next-generation)
→ Massive parallel sequencen clonaal in vitro geamplificeerde DNA moles (Illumina, Ion Torrent)
+: hele genoom door 1-2 wet.ers & machines, sneller, goedkoper
Third-generation sequencing (=next-next generation)
→ individuele lange DNA moles sequencen ZONDER amplificatie nodig (Nanopore, Pacific Biosciences)
+: lange genomen sequencen
+: hele genoom door 1 wet.er, met 1 machine, heel goedkoop, snel
Toepassingen genoom sequencing:
De novo genoom sequencing
= voor 1e x onbekend genoom sequencen (bv. Humane Genome Project)
Methode: OVERLAPPEN nodig
=> bepalen hoe de stukjes DNA sequentie in elkaar passen
-: moeilijk
Uitdaging: repetitieve sequenties in genoom
=> sequentie past op ≠ plekken
Resequencing
= sequencen genoom van gekend organisme bv. van mens → Humane genoom als referentie
Methode: mappen genoom tov REFERENTIEGENOOM => sequenties genoom aan elkaar plakken
+: eenvoudig
Toepassingen:
- SNPs tussen ≠ individuen bepalen
- Mutaties bij ziekten - Construct verificatie
- Klinische toep.: diagnose, NIPT (= prenataal DNA foetus sequencen)
farmacogenetiga (≠ mensen reageren anders op gnsmddl door ≠ in genoom)
Sequentiebepaling als teller (<>volgorde basen)
= # DNA (of RNA) moles tellen (RNAseq, ChIPseq)
bv. transcriptomics: RNA → cDNA => sequencen => expressie transcript tellen
WGS = Whole genome sequencing = hele genoom sequencen
WES = Whole exome sequencing
= alle exonen genoom = coderende sequenties = 1,5% genoom => sneller, goedkoper
Targeted sequencen = specifiek gen sequencen => goedkoper, sneller
,Transcriptoom sequencing = 1e RNA → cDNA => cDNA sequencen
1ste generatie sequentiebepaling
Methoden: Sanger of Maxam en Gilbert
Maxam en Gilbert (historisch, ter info)
Chemische klievingsmethode
1) Radioactieve merking => visualisatie DNA
→ Fosfaatgroepen ℗ 5’ uiteinde vervangen dr radioactief ℗
2) Restrictie-enzym (RE) => 1 kant label afgooien => dsDNA langs 1 kant gemerkt
=> enkel radioactief gemerkte streng zichtbaar
3) Chemische klieving v. nucleïnezuren in 4 ≠ reacties:
verdeel moles over 4 buisjes + voeg chemische stof toe
=> breuk in DNA na specifieke base
- Buis 1: breuk na G (niet elke G, soms de 1e, soms 4e, …)
- Buis 2: na A OF G - Buis 3: na C OF T - Buis 4: na C
4) Buisje op agarosegel => scheiding DNA frag op grootte
-> boven = groot = 3’ <> onder = klein = 5’ uiteinde
5) Autoradiografie => visualisatie DNA
6) Sequentie aflezen: bv. C en CT reactie positief => C
Nadeel: korte fragmenten, niet heel specifiek (soms dubbele bandjes)
Sanger sequencing
Nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
Normale dNTP = deoxy = 3’ OH (2’OH weg) => nieuwe base kan koppelen (fosfodiesterbinding)
Dideoxy = 3’OH weg => volgende nt kan niet koppelen => ketenterminatie
1) Template/ matrijs = PCR amplicon of clone van genomisch DNA-fragment
2) Polymerase + primer + mengsel dNTPs + kleine fractie ddNTPs, fluorescent gemerkt
3) Pol vertrekt vanaf primer => °dsDNA complementair aan te sequencen frag
a) meestal: inbouw normale => ketenverlenging
b) soms: inbouw ddNTP => terminatie reactie
°vele: fragmenten met andere lengte
4) Capillaire of gel elektroforese => scheiding frags
=> fluorescent label bepaald sequentie (elke ddNTP ander kleurtje)
=> °elektroferogram (kleine frags 1e)
Nadeel:
- Beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
- Soms elektroferogram geeft oververlappende seq.:
scheiding op lengte, maar C & G => lusje: vouwen DNA frag => sneller dr capillair => overlap
Voor betrouwbaarheid: 2 aparte reacties met FW & RV primer => in beide richtingen aflezen
Voordeel: mutatiedetectie mogelijk:
diploid genoom: zie piek C & T tegelijk => heterozygoot/mutatie
→ nadeel: pieken niet altijd even hoog
=> kan ook sequentiefout zijn ipv mutatie => oplossing: FW & RV reactie
,Aflezen elektroferogram dmv software
- 1e 30bp niet afleesbaar -- 500-700bp afleesbaar (max. 1000bp) (kleine fragmenten)
- Kwaliteitsscore per base = Phred-score = acuraatheid v/d basecall
→ score 10 = 1/10 base = fout = slecht = 90% accuraat
→ wil score 20-30 => 99-99,9% accuraatheid
→ slide 11: base calling met Phred-score per base: Hoog balkje = score > 20 vr deze base <> laag balkje = score <20
Verwezenlijkingen Sanger
HumaneGenomeProject (HGP) = de novo sequencing humane genoom
└> duur, vele labo’s, ≠ stalen DNA’s v. ≠ individu’s
└> methode: hiërarchische shutgun sequencing met Sanger = adhv MAPPEN
= 1) kloneren grote stukken DNA in YACs en BACs
2) grote stukken mappen + RANDOM fragmentatie & dan kleine stukken mappen
=> Publicatie: 1e draft seq. (=1e humane seq.)
Later finale seq. (nog kleine stukjes missen, nogsteeds updates)
Nu dit = referentiesequentie v/h Humane genoom in databanken (NCBI, …)
Humane Genome sequencing dr Celera (Venter) = ook de novo sequencing humane genoom
└> genoom van 5 individu’s (<>mengsel genomen), binnen 1 bedrijf
└> methode: whole genome shutgun sequencing = ZONDER mappen (<>HGP: mappen & kloneren)
= 1) ganse genoom fragmenteren in kleine stukken => random clones
2) sanger sequencen => aan elkaar hangen
=> probleem: repetitieve sequenties => moeilijk aan elkaar hangen (niet 1e mappen)
=> Toepassing: vgl dit genoom van 1 individu met referentie (HGP) => 3miljoen verschillen per ind.!
Enorme impact op:
- Technologische ontw. v. sequencing: - automatisering => prijs ↓↓ + sequentiedata ↑
- aanpak (bv. sommige delen chr onmogelijk kloneren)
- Ontwikkeling bio-informatica
- Visie delen data : !Open sience: MOET alle data delen in db => gebruik dr andere OZ’er
→ !belang patenteren (even tot bijhouden, daarna publiceren & patent op pakken)
- °Andere methoden dr gekende sequentie
- Biologische kennis:- sequentie en organisatie ~ alle humane genen gekend
- vergelijkende genomics: inzicht in evolutie, in geconserveerde processen
- genetische verschillen tussen mensen
°Nieuwe uitdagingen: we willen:
- Volledige sequentie (telomeer – telomeer) -- Genomen meer species
- Persoonlijke genoom van iedereen => Personalizied precision medicine !!!:
o Kennis DNA volgorde & SNPs => diagnose, prognose, preventie
→ persoonlijke genoomseq. => zie voorbeschikte vr bep. ziektes bv. longkkr bij roken
=> meer PREVENTIEF werken (aanleg voor ziekte?)
o Therapie op maat bv. elke kkrpatiënt ≠ mutaties in kkrcellen => doelgerichte & gepers. therapie
o Farmacogenomics: reactie op bep. gnsmddl afh. bep. SNP in genoom
=> goede gnsmddl k o/d markt blijven
o Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
o Ethische aspecten bv. gekend genoom => enkel slimme mensen aannemen
, Probleem Sanger seq.: lage throughput & duur => °2nd generation: hoge capaciteit & goedkoop
2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation sequencing
= Next generation sequencing (NGS)
Hoge throughput (1 genoom per toestel per dag) & lage kost
obv massive parallel sequencing
Nieuwe technologie met 3 pijlers:
1) Massive parallel sequencing (parallelle detectie)
= korte stukjes DNA sequentie , massaal & in parallel (tegelijk) sequencen:
klonale in vitro amplificatie v. template (<> klassieke klonering: geen bact. nodig)
=> ° clusters/ polonys = 103 - 106 kopieën DNA template
+: snel (geen gels, kloneren, …)
+: multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie) => hoge throughput
2) Miniaturisatie reacties
3) Hele proces integreren => directe detectie (<> scheiding frags via elektroforese)
Commerciële platformen voor 2nd generetion
454 (oud), SOLID (vroeger), Illumina (nu)
- Zeer competitief (telkens °nieuwe & andere verdwijnen) + snelle evolutie
4 stappen = basis ALLE platformen
1) Aanmaak DNA libary: genomisch DNA in stukken knippen + adaptoren vasthangen
2) Klonale in vitro amplificatie
3) Sequentiebepaling dmv ≠ nieuwe methodes (<>Sanger)
4) Data analyse
Stap 1: aanmaak NGS DNA library
Library = bank fragmentenbank = verz. te sequencen templates
Types DNA library:
- Whole genome sequencing (WGS)
- Mate Pair librairies = 2 uiteinden, met vaste afstand tss sequenties
- Amplicon sequencing: PCR amplicons (= stuk chr seq.)
- cDNA librarys: RNA → cDNA => info transcriptoom (hfst 2.3)
- Whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
bv. mutatie in coderend gen => enkel seq. exonen
→ ! METHODE 1: Aanrijking door hybridisatie aan probes (in opl. of op array) (A):
Hybridisatie frag. bank aan micro-array (vaste drager)/beads met oligo’s complementair
aan exonseq. => enkel exonseq. hybridiseren (~1% genoom) + introns weggewassen
=> opgezuiverd exonseq.
→ ! METHODE 2: PCR-methode (B):
PCR primers tgn alle exonseq. => °PCR amplicons: enkel amplificatie exonseq.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller paulinebal. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $14.47. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67096 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now