Summary
Samenvatting Moleculaire Celbiologie
- Course
- Institution
Samenvatting van de cursus 'Moleculaire Celbiologie'
[Show more]
Seller
Followdriesluyten
Content preview
Samenvatting Moleculaire celbiologieHoofdstuk 9: Visualiseren van cellen en moleculen via
lichtmicroscoop en elektronmicroscoop
9.1. Algemene informatie
Organismen zijn opgebouwd uit cellen MAAR: vanaf wanneer wist men dat er
cellen bestonden? nadat de 1ste microscopen (300-350 jaar geleden 1600)
gemaakt waren wist men dat er cellen waren want cellen zijn te klein om met het
blote oog te zien dus er waren die hulpmiddelen nodig
o Plantcel = 70-100 micrometer
Kunnen we met lichtmicroscoop
bestuderen want kan objecten
o Dierencel = 10-30 micrometer
tot 200 nm onderscheiden
o Kleiner dan 1 micrometer we bevinden ons op het niveau van de
celorganellen (en moleculen) kan nog via lichtmicroscoop, maar voor
meer nauwkeurige beelden kan best elektronmicroscoop (kan objecten tot
0,1 nm = 1A onderscheiden) worden gebruikt
o Blote oog kan objecten onderscheiden vanaf 300-400 micrometer
objecten moeten minimaal deze grootte hebben opdat ze met het blote oog
gezien en onderscheiden kunnen worden als een individueel object
Scheidend vermogen = de minimumafstand waarop 2 objecten zich van elkaar
kunnen bevinden en nog als individuele objecten waar te nemen zijn die afstand is
het scheidend vermogen (wordt ook resolutie genoemd)
o Lichtmicroscoop: 200 nm objecten die dichter dan 200 nm bij elkaar liggen
zijn niet als individuele objecten waar te nemen
o Elektronmicroscoop: 0,1 nm (=1A) heeft dus een groter scheidend
vermogen om kleinere elementen van elkaar te onderscheiden is er
microscoop nodig die een grotere golflengte gebruikt (grotere golflente =
groter scheidend vermogen) elektronmicroscoop doet dit
Belangrijke ontdekkingen in de geschiedenis van de lichtmicroscoop
o Kepler: stelde een manier voor om een compound microscoop te maken
o Hooke: gebruikte compound microscoop om kleine poriën in secties van kurk
te beschrijven (hij noemde het cellen)
o Leeuwenhoek: rapporteerde zijn ontdekking van protozoa hij ziet
bacteriën voor de eerste keer
Dus is de eerste die cellen kon waarnemen (ontdekte) zag bacteriën
die bewogen in een druppel
Zijn microscoop = veredeld vergrootglas: glas dat voldoende geslepen
was om goede breking te hebben en zo cel te zien
o Zie afbeelding compound (licht)-microscoop dia 4
1
, Sterkste objectief = 100x
Sterkste eyepiece = 10-15x geven nog eens 10x vergroting
Dus 100 . 10 = 1000x microscoop geeft een maximale vergroting
van 1000x dus 1000 keer beter scheidend vermogen dan wij (met
blote oog)
Licht heeft een golfkarakter en geeft diffractie
o Lichtgolven in fase versterken elkaar
signaal is intenser
o Lichtgolven uit fase (tegenfase)
werken elkaar tegen / doven elkaar
(bijna) uit afzwakking van signaal
(lagere intensiteit van licht)
o Diffractie = afbuiging van een
lichtgolf langs een ondoordringbaar obstakel
Zowel bij lineaire als circulaire voorwerpen
Is gevolg van het golfkarakter van licht
Als dus licht schijnt op een scherpe rand °
diffractiepatroon
Nu wordt er dieper ingegaan in de resolutie van de lichtmicroscoop:
o Condensor lens focusseert een kegel van lichtstralen op
ieder punt van het specimen
o De objectief lens collecteert/verzamelt een kegel van
lichtstralen om een afbeelding te creëren
o Resolutie = de oplossende/scheidende kracht van
microscoop hangt af van de breedte van de kegel van
verlichting (op het specimen) en daarom dus van de condensor- en
objectieflens
Formule: resolutie = 0,61 λ/ nsinθ
Opm. hoe kleiner de resolutie is hoe beter ze eigenlijk is want dan
kan je kleinere objecten van elkaar onderscheiden
Θ = de helft van de hoekbreedte van de kegel van lichtstralen,
gecollecteerd door de objectieflens vanuit een bepaald punt in het
specimen maximum kegelbreedte is 180° dus θ kan maximaal 90°
zijn sin90° = 1 DUS: hoek θ best zo groot mogelijk krijgen voor
het beste beeld/resolutie (= kleiner resultaat) te hebben om naar
limiet te gaan moet je dus objectief dicht bij preparaat leggen want
dan wordt de hoek groter
N = refractaire index van het medium (meestal lucht of olie) die het
specimen scheidt van objectief en condensorlens
Lichtstraal verandert van richting door refractaire index van het
gebruikt medium
λ = golflengte van gebruikte licht (wit licht 0,53 micrometer)
nsinθ wordt numerische apertuur (NA) genoemd
Is functie van de licht-collecterende mogelijkheid van de lens
2
, Voor droge lenzen kan max 1 zijn
Olie-imersie lenzen kan max 1,4 zijn (omdat olie een n
heeft van 1,51 en lucht maar van 1 olie = immersievloeistof
zo krijg je betere resolutie (wel immersielens gebruiken))
hoe hoger NA hoe kleiner resolutie (dus hoe beter) en hoe
helderder/intenser het beeld is
ABBE heeft deze formule ontdekt + ontdekte ook dat resolutie
gelimiteerd wordt door de diffractie van licht als sferische golven
door circulaire aperturen van objectief passeren + ontdekte ook dat de
optimale resolutie niet werd gerestricteerd door de kwaliteit van de
lens, maar wel door golflengte van gebruikte licht en apertuurhoek
(θ) van objectief nu probeert men de limieten van diffractie te
verbeteren (want is fysische limitatie/barrière voor betere resolutie)
door benaderingen die gebaseerd zijn op de reversibele
fotoswitsching van fluorescente probes om zo supperresolutie-
imaging te bekomen
o De limieten van microscopische resolutie
zie afbeelding: door het beeld te vergroten
ga je resolutie/scheidend vermogen niet
meer kunnen verbeteren want deze
resolutie hangt enkel af van de NA van de
lens en de golflengte van het gebruikte lens
Beide beelden zijn hier 200x
vergroot (want 20.10 en 4.50), maar
hebben niet dezelfde resolutie want
deze wordt enkel bepaald door de NA van de lens
Links figuur heeft hogere NA dus betere resolutie dan rechtse
(dus ook al hebben ze dezelfde vergroting, omdat de NA
anders is gaat resolutie ook anders zijn vergroting kan
resolutie dus niet verbeteren)
Dit wordt ook ‘empty magnification’ genoemd
We kunnen 2 structuren lokaliseren als ze verder dan de straal van
het airy disk patroon van elkaar liggen en we kunnen 2 structuren
enkel co-lokaliseren als ze binnen de straal van het airy disk patroon
liggen (want dan niet perfect te lokaliseren) dia 9 vragen wat ermee
bedoeld wordt (is het juist wat hier geschreven is??
Links = 1 object geeft diffractiepatroon
Midden = 2 objecten die nog juist te onderscheiden zijn als
afzonderlijke objecten dit is het airy-disk patroon
Rechts = 2 objecten waarvan diffractiepatroon te hard overlapt
omdat ze te dicht bij elkaar liggen liggen binnen de straal
van het airy-disk patroon van
elkaar niet meer afzonderlijk te
lokaliseren
3
, Met goede lichtmicroscoop minimale oplossende afstand
Laterale resolutie (in x-en y-as/vlak): 200-250 nm
Axiale resolutie (in z-as): 500 nm
Deze afstanden zijn niet klein genoeg (niet dicht genoeg) om
moleculaire interacties aan te tonen want 200nm is nog groot
op cellulair niveau je gaat nooit de afzonderlijke moleculen
in de cel kunnen zien (en hun interacties dus ook niet) omdat
deze dichter dan 200 nm van elkaar liggen (je ziet ze als 1)
Bekijk figuur dia 9
o Temporele en spatiale resolutie
Temporeel = hoe lang we de resolutie kunnen aanhouden
Spatiaal = …
Zie tekening dia
Tekening dia 11: om naar cel te kijken is er goede/juiste microscoop nodig en moet
het celpreparaat goed gemaakt zijn
o Is nodig want chemische elementen van de cel zijn C, H, O, N atomen met
atoomgewicht/massa kleiner dan 20 en ze verschillen onderling ook heel
weinig qua atoommassa organellen bestaan ook uit deze atomen DUS:
er zit weinig contrast in de verschillende organellen van de cel er zijn dus
technieken nodig die zorgen voor een groter contrast tussen de organellen
(en dus niet lichtmicroscoop) omdat de cel dus translucent is = van nature
weinig contrast
o Een aantal voorbeelden van technieken die we kunnen gebruiken:
Darkfield-illumination = schuin invallen van lichtstralen materiaal
doet licht afbuigen: als licht materiaal tegenkomt wordt het
afgebogen, als het geen materiaal tegenkomt wordt het niet
afgebogen enkel het gescatterde/afgebogen licht valt in op
objectief meer contrast
Door gebruik te maken van verschil in fase via de
fasecontrastmicroscoop licht interageert met cellulaire
componenten hierdoor ontstaat faseverschuiving: deze
verschuiving is anders voor dikkere (veel verschoven) en dunnere (zo
goed als niet verschoven) regio’s van de cel fasecontrastmicroscoop
kan deze uit-fase-golven combineren en dan deze faseverschillen
omzetten in zwart-wit beelden/tinten ° contrast
Bright-field illumination staal wordt belicht met wit licht
contrast wordt gegenereerd door attenuatie (verzwakking) van
getransmitteerd (uitgezonden) licht in dense gebieden van de cel °
veel contrast (°donker staal op lichte achtergrond)
Deze 3 technieken cel leeft nog (niet gekleurd)
Nog een techniek: bepaalde sectie van de cel kleuren (reageert met
zure groepen) hierdoor zullen bepaalde golflengten worden
doorgelaten en andere niet vb. rood licht (licht met die golflengte)
zal worden doorgelaten, maar de andere golflengten van ingestraalde
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller driesluyten. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $21.99. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67474 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now