Samenvatting Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 H3 RNA (E0F94a)
91 views 5 purchases
Course
Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 (E0F94A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Samenvatting Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 (E0F94a)
In dit document staat alles wat je moet weten over H3 RNA. Het is een mix van de slides van de prof en college aantekeningen. Samenvatting is duidelijk en overzichtelijk geschreven.
DNA RNA
- Ribose; is onstabiel en vatbaar voor afbraak
- Deoxyribose - Uracil
- Thymine - Enkelstrengig; secundaire en tertiaire structuur
- Dubbelstrengig in mogelijk omdat er onderlinge bindingen
dubbele helix kunnen ontstaan
- Langer - Korter
- 2’H - 2’OH; hierdoor is RNA vatbaarder voor afbraak
door RNAsen en daardoor is RNA dus korter
Soorten RNA
● mRNA = coderend messenger RNA, template voor eiwitten (1-4% van het totaalgewicht)
● rRNA = ribosomaal RNA voor verschillende subunits (80-95% van het totaalgewicht)
● tRNA = transfer RNA dat fysische link vormt tussen mRNA en eiwit
● short ncRNA (< 200 nucleotiden)
o miRNA = niet coderend, speelt rol in gezondheid en ziekte
o piRNA = piwi-interacting RNA (interageert met piwi proteïnen), belangrijk in
kiemcellen en dus vruchtbaarheid
o siRNA = short interfering RNA, belangrijk bij genexpressie
● long ncRNA (> 200 nucleotiden)
● Circulair RNA = recent ontdekt, functie nog onbepaald
Structuur mRNA
,Pre- mRNA is heel vluchtig en bevat nog de intronen.
Mature RNA= 5’ gemodificeerde groep, 5’UTR, protein-coding sequence, 3’UTR, poly-A staart
2.3.1 RNA verzorgen en bewaren
● Mogelijke problemen:
– RNA profiel verandert na staalname, bv inductie genen
– RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAsen
– DNA contaminatie: scheiding DNA/RNA meestal onvolledig
● Staalname:
‒ Keuze anticoagulans (antistollingsmiddel): best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA
reacties met PCR
→ Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C). Pas daarna kan je
het DNA stabiliseren.
→ Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv PAXgene tube.
→ Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel.
- bv RNAlater (ammoniumsulfaat oplossing). Dit precipiteert eiwitten. Dat betekent dat
de eiwitten gaan neerslaan en zo niet meer RNA kunnen afbreken of wijzigen. Dit
moet je verwijderen voor extractie,.
- of Trizol (= al eerste stap van extractie)
● Staalverwerking: RNAse-vrij werken!
– Zeer zuiver werken: dat betekent labojas en handschoenen om stalen te beschermen,
afgebakende labo/bench-zone voor RNA werk, een RNAse schoonmaakproduct (RNAse ZAP)
gebruiken voor de oppervlakten & pipetten.
‒ RNAse vrije filter-pipettips en plastics
‒ Nuclease-vrije oplossingen/water:
- gefilterd water (Milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- behandeling met RNAse inhibitoren
■ DEPC (diethyl pyro carbonaat, carcinogeen): reageert met amines in
aminozuren, voornamelijk histidine, in de katalytische site van RNAsen en
inhibeert deze (Tris is een amine, en dus werkt DEPC niet in een Tris-buffer)
■ nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
● Bewaring
‒ RNAse-vrij water (of TE-buffer, maar EDTA inhibeert RNAse niet. Het inhibeert wel
DNAsen)
‒ bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)
, ‒ langere bewaring eventueel als alcohol precipitaat
‒ beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie bewaren
● DNA contaminatie
Is niet altijd een probleem, bijvoorbeeld niet wanneer de toepassing onderscheid maakt
tussen DNA/RNA
‒ Detecteren: RTmin controle & Elektroforese
– Verwijderen: DNAse behandeling
‒ DNase toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
‒ DNase knipt dsDNA en ssDNA of alleen dsDNA bij dsDNA-specifieke DNAsen
‒ Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
Het nadeel aan deze behandeling is het mogelijke verlies of degradatie van RNA.
2.3.2 RNA extractie
Methode =
- afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen,.....)
- afhankelijk van doel (hoeveel nodig, welke kwaliteit, ...)
Essentiële stappen:
1. Lysis = weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt. Lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk.
2. Isoleren = RNA uit het lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)
3. Oplossen = RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren.
, Lyseren:
De eerste stap is de extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3) of eiwitten (Hfdst 2.4)
Verschillende methoden, afh. van weefsel/celtype, volume en aantal stalen, moleculen en
toepassing.
- Vaak de toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNAsen, RNAsen,
proteasen.
- De meest gebruikte methode is het toevoegen van detergenten, bv. SDS, Trizol (guanidium
thiocyanaat), guanidium chloride, …
- Snel vriezen en ontdooien maakt de cel kapot: lyseren is het tegenovergestelde van
cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te houden.
- mechanische homogenisatie:
‒ pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel. wordt gebruikt om weefsel
stuk te maken.
‒ Dounce homogenisator of “Douncer”: oplossing tussen glazen pestels
‒ voordeel: mild, laat celfracties (organellen) intact
- sonicatie (geluidsgolven):
- nadeel: kan ook DNA/RNA fragmenteren
- gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie
2.3.2.1 RNA extractie met organische solventen
meest gebruikte detergent bij RNA is Trizol
● Trizol = acid (zuur, pH = 4-5)
● Guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
● Guanidium thiocyanaat zorgt voor cel lysis en is een RNAse inhibitor die zou het RNA intact
gaat laten.
● Toevoegen, goed mengen, RNA nu gescheiden van DNA en eiwitten
- organische laag bevat de eiwitten en lipiden
- interfase laag bevat DNA
- waterlaag bevat RNA → kunnen we afnemen en overbrengen naar een andere tube
en zo verder gaan met ofwel alcohol precipitatie ofwel kolomchromatografie
● Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller SarahSilke. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.27. You're not tied to anything after your purchase.
