Summary
Samenvatting Methoden in het biomedisch onderzoek 1 Hoofdstuk 11 Elektroforese en Western blot
- Course
- Institution
Samenvatting hoofdstuk 11 Elektroforese en western blot
[Show more]
Seller
Follow
elienbloemen
Reviews received
Content preview
Methoden in biomedisch onderzoekHoofdstuk 11: elektroforese en western blot
Introductie elektroforese
Principe
o Systeem:
elektrisch veld doet geladen deeltjes bewegen
gel werkt als zeef
scheiding volgens lading en/of massa (= grootte)
o Twee gelsystemen
Agarose gel =
Polysaccharide: polymeer van agarobiose, akomstig van zeewier en niet-
toxisch
Horizontale gels die aan scheiding van nucleïnezuren (DNA/RNA) doen
Polyacrylamide gel
Cross-linked polymeer van acrylamide (acrylamide = neuro-toxisch)
Verticale gels dia aan scheiding van eiwitten doen met een kleinere
poriegrootte dan agarose gel Scheiding van kleine DNA fragmenten
Scheiding van nucleïnezuren op een agarose gel
Werkwijze
o Gieten van de gel
agarose poeder met buffer opwarmen -> agarose smelt (buffer: TAE (Tris-acetaat-
EDTA) of TBE (Tris-boorzuur-EDTA))
afkoelen in gel tray met kam
o Staalvoorbereiding: mengen staal met laadbuffer
kleurstof om migratie staal te volgen (bromofenolblauw, xyleencyanol)
glycerol om staal zwaarder te maken dan elektroforesebuffer
o Gel laten lopen
o Visualiseren eiwitten via eiwitbindende stoffen
Toegevoegd bij het maken van de gel of gekleurd na lopen gel
Ethidiumbromide (EtBr)
zichtbaar signaal onder UV licht (DNA schade)
zeer gevoelig (detecteert band 1-5 ng DNA)
toxisch en mutageen/carcinogeen
SYBRsafe
zichtbaar onder blauw licht (en UV)
zeer gevoelig (detecteert band 1-5 ng DNA)
minder mutageen (maar wel toxisch en met nodige voorzichtigheid
hanteren!!!!)
Toepassingen
Nakijken lengte DNA fragment (ladder als referentiepunt)
Scheiden van DNA fragmenten voor opzuivering
Nakijken integriteit van RNA (intacte 28S en 18S ribosomaal RNA banden in
eukaryoot RNA)
, Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)
SDS-page = scheiding van eiwitten volgens massa
o Principe
Gevouwen (natieve) eiwitten met positieve en negatieve ladingen denaturatie
SDS = sodium dodecyl sulfaat, een ionisch detergent dat bind aan aminozuren en
ontvouwt eiwitten en zorgt voor een uniforme negatieve lading
Ongevouwen lineaire structuur met negatieve lading proportioneel aan lengte (en
dus massa) van het eiwit
o Twee gels
Stacking gel : bovenaan met lager percentage PA, concentreert het staal voor het in
scheidingsgel terecht komt
Betere resolutie scheiding en scherpere banden
Scheidingssgel : onderaan, een hoger percentage PA dat vast of in een gradiënt kan
zijn, scheiding van eiwitten volgens lengte
Isoelectric focussing (IEF) = scheiding van eiwitten volgens lading
o Lading
De lading van een eiwit is afhankelijk van de aminozuursamenstelling (Lys, Arg, His
maakt positief terwijl As of Glu negatief maakt)
De lading van de aminozuren is afhankelijk van de pH wat betekent dat in sommige
pH milieus het eiwit toch geen netto lading heeft isoelektrisch punt
Omdat de aminozuursamenstelling dit punt bepaalt kunnen we via die gegevens
scheiden
o Denaturatie
Zodat alle aminozuren kunnen worden blootgesteld aan de omgevng
Gel nodig met geïmmobiliseerd pH gradiënt
2D elektroforese = scheiding in twee dimensies voor complexe mengsels (IEF en SDS-PAGE elk in een
dimensie)
o Voordelen:
Goede resolutie van eiwitten: 2000 spots per gel die nog te verbeteren zijn via
prefractionatie (cel fractionatie, chromatografie, pH regio’s,…)
Detectie posttranslationele modificaties
Detectie van eiwitten die al dan niet aanwezig zijn in verschillende stalen
o Nadelen
Niet geschikt voor hydrofobe eiwitten (bv. Membraaneiwitten)
Beperkt door pH regio
Analyse en kwantificatie zijn moeilijk
Beperkte hoeveelheid eiwit kan geladen worden
Native PAGE = scheiding volgens lading, massa en vorm (geen denaturatie)
o Toepassing
Opzuiveren eiwitten met enzymatische activiteit
Bepalen van quaternaire structuur eiwit (monomeer, dimeer, trimeer,...)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller elienbloemen. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.77. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67479 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 15 years now