NF5 APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE TINCIÓN M05 PROCESAMIENTO
1.FUNDAMENTOS Y MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN
El fundamento de cualquier tinción es la capacidad de los tejidos para incorporar y fijar de
modo variable diversas sustancias coloreadas denominadas colorantes.
Tipos de colorantes
- Colorantes naturales: hematoxilina, deriva del tallo del palo de Campeche
(Haematoxylum campechianum); carmín, safranina, orceína…
- Colorantes artificiales: la mayoría deriva de la anilina: fenilamina; son los más usados
en histología.
- Anillo de benceno: es incoloro, pero al fijarse uno de los dobles enlaces devuelve color al
absorber parte del espectro de luz visible. (átomos de carbonos unidos entre ellos mediante
dobles enlaces, debido a las características de la molécula son inestables, cuando los
enlaces son inestables no da color). La mayoría de colorantes presentan este anillo.
1.1 Cromóforo
Las moléculas orgánicas con anillos aromáticos pueden tener electrones asociados o
combinaciones de átomos denominados cromóforos (los más abundantes grupo nitro
(-NO2), etileno (>C=C<), triazólico (>C=S), el nitroso (-N=0), el grupo indamina (imino)
(>C=N-), el grupo azo o azoico (-N=N-) y la configuración quinónica).
Fijación del doble enlace se consigue al fijar el cromóforo al anillo acromático: el cromóforo
es responsable del color.
Molécula con anillo acromático+ grupo cromóforo= cromógenos.
Estructura química del grupo cromóforo
Según la estructura química y el grupo cromóforo:
- Colorantes nitrados o nitrosados: son nitro-(-N02) o nitroderivados (-N=0) de anillos
aromáticos como el benceno. Ej: ácido pícrico.
- Colorantes azoicos: contienen el cromófor -N=N- uniendo anillos adyacentes derivados
(Sudán negro) o menos probable tetrazoicos (rojo sirio F3B). Pueden ser aniónicos o
catiónicos, formar complejos metálicos o tener carácter de lipocromo (se disuelven en
lípidos).
- Derivados de la antraquinona: se consiguen de la oxidación del antraceno para construir
anillos quinónicos. Ej: nuclear fast red (rojo nuclear rápido).
- Derivados de la acridina: presentan un N en el enlace de los anillos bencénicos.
Contienen un cromóforo imino (>C=N-). Ej: naranja de acridina, usado solo como
fluorescencia.
- Flavonoides: cromógeno es la estructura flavona. Incluye colorantes naturales y
artificiales producidos por procesos de oxidación. Ej: hematoxilina.
1
, 1.2 Auxocromo
Otro requisito del colorante es que se pueda unir al tejido, esto lo realiza el grupo
auxocromo.
Grupos auxocromos encontramos:
- Grupos auxocromos básicos (colorante con carga neta positiva -> colorante catiónico)
-> aminas.
- Grupos auxocromos ácidos (carga negativa -> colorante aniónico) -> grupos sulfónicos,
carboxilo o hidroxilo de compuestos fenólicos.
Naturaleza química de los colorantes
Los colorantes suelen ser hidrosolubles y se unen a moléculas por afinidad química
Se suele usar un exceso de colorante a T ambiente -> Proporción baja del total de
moléculas unidas/moléculas del colorante -> Protocolos presentan pasos de lavado para
eliminar el exceso de colorante.
2 progresiones de la tinción:
- Tinción progresiva: La coloración va en aumento lentamente hasta que se interrumpe el
proceso, eliminando el sobrante al llegar a la coloración deseada.
- Tinción regresiva: Sobre tiñe las estructuras y luego va eliminando la coloración por
soluciones que revierten la unión entre el colorante y el sustrato. Este procedimiento se
suele llamar “diferenciación”.
El éxito de la tinción depende de:
- Capacidad de los colorantes de unirse selectivamente (diversidad en la afinidad)
- Debe ser compatible con el fijador y el tipo de inclusión
- Protocolos deben ser estandarizados
- Puede ser necesario utilizar controles para evaluar si la tinción es adecuada
MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN (Cómo se unen los colorantes al
tejido).
1.Fisicoquímico:
- Relaciones electroestáticas: Uniones intermoleculares por relaciones electroestáticas,
uniéndose:
- Colorantes ácidos (aniónicos) a estructuras básicas
- Colorantes básicos (catiónicos) a estructuras ácidas
- Enlaces coordinados, mordientes y quelantes:
- Enlaces mordientes: ayudan a la formación de complejos coloreados insolubles.
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1.FUNDAMENTOS Y MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN
El fundamento de cualquier tinción es la capacidad de los tejidos para incorporar y fijar de
modo variable diversas sustancias coloreadas denominadas colorantes.
Tipos de colorantes
- Colorantes naturales: hematoxilina, deriva del tallo del palo de Campeche
(Haematoxylum campechianum); carmín, safranina, orceína…
- Colorantes artificiales: la mayoría deriva de la anilina: fenilamina; son los más usados
en histología.
- Anillo de benceno: es incoloro, pero al fijarse uno de los dobles enlaces devuelve color al
absorber parte del espectro de luz visible. (átomos de carbonos unidos entre ellos mediante
dobles enlaces, debido a las características de la molécula son inestables, cuando los
enlaces son inestables no da color). La mayoría de colorantes presentan este anillo.
1.1 Cromóforo
Las moléculas orgánicas con anillos aromáticos pueden tener electrones asociados o
combinaciones de átomos denominados cromóforos (los más abundantes grupo nitro
(-NO2), etileno (>C=C<), triazólico (>C=S), el nitroso (-N=0), el grupo indamina (imino)
(>C=N-), el grupo azo o azoico (-N=N-) y la configuración quinónica).
Fijación del doble enlace se consigue al fijar el cromóforo al anillo acromático: el cromóforo
es responsable del color.
Molécula con anillo acromático+ grupo cromóforo= cromógenos.
Estructura química del grupo cromóforo
Según la estructura química y el grupo cromóforo:
- Colorantes nitrados o nitrosados: son nitro-(-N02) o nitroderivados (-N=0) de anillos
aromáticos como el benceno. Ej: ácido pícrico.
- Colorantes azoicos: contienen el cromófor -N=N- uniendo anillos adyacentes derivados
(Sudán negro) o menos probable tetrazoicos (rojo sirio F3B). Pueden ser aniónicos o
catiónicos, formar complejos metálicos o tener carácter de lipocromo (se disuelven en
lípidos).
- Derivados de la antraquinona: se consiguen de la oxidación del antraceno para construir
anillos quinónicos. Ej: nuclear fast red (rojo nuclear rápido).
- Derivados de la acridina: presentan un N en el enlace de los anillos bencénicos.
Contienen un cromóforo imino (>C=N-). Ej: naranja de acridina, usado solo como
fluorescencia.
- Flavonoides: cromógeno es la estructura flavona. Incluye colorantes naturales y
artificiales producidos por procesos de oxidación. Ej: hematoxilina.
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, 1.2 Auxocromo
Otro requisito del colorante es que se pueda unir al tejido, esto lo realiza el grupo
auxocromo.
Grupos auxocromos encontramos:
- Grupos auxocromos básicos (colorante con carga neta positiva -> colorante catiónico)
-> aminas.
- Grupos auxocromos ácidos (carga negativa -> colorante aniónico) -> grupos sulfónicos,
carboxilo o hidroxilo de compuestos fenólicos.
Naturaleza química de los colorantes
Los colorantes suelen ser hidrosolubles y se unen a moléculas por afinidad química
Se suele usar un exceso de colorante a T ambiente -> Proporción baja del total de
moléculas unidas/moléculas del colorante -> Protocolos presentan pasos de lavado para
eliminar el exceso de colorante.
2 progresiones de la tinción:
- Tinción progresiva: La coloración va en aumento lentamente hasta que se interrumpe el
proceso, eliminando el sobrante al llegar a la coloración deseada.
- Tinción regresiva: Sobre tiñe las estructuras y luego va eliminando la coloración por
soluciones que revierten la unión entre el colorante y el sustrato. Este procedimiento se
suele llamar “diferenciación”.
El éxito de la tinción depende de:
- Capacidad de los colorantes de unirse selectivamente (diversidad en la afinidad)
- Debe ser compatible con el fijador y el tipo de inclusión
- Protocolos deben ser estandarizados
- Puede ser necesario utilizar controles para evaluar si la tinción es adecuada
MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN (Cómo se unen los colorantes al
tejido).
1.Fisicoquímico:
- Relaciones electroestáticas: Uniones intermoleculares por relaciones electroestáticas,
uniéndose:
- Colorantes ácidos (aniónicos) a estructuras básicas
- Colorantes básicos (catiónicos) a estructuras ácidas
- Enlaces coordinados, mordientes y quelantes:
- Enlaces mordientes: ayudan a la formación de complejos coloreados insolubles.
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