Samenvatting Moleculaire Genetica, Hoofdstuk 6 (T. Voet) BMW
6 views 0 purchase
Course
Moleculaire Genetica
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Book
Human Molecular Genetics
Samenvatting van hoofdstuk6: Core DNA Technologies , Moleculaire Genetica door T. Voet en op basis van mijn notities en slides van de les. Voor de richting Biomedische Wetenschappen.
● Cel-gebaseerde klonering
○ Complex DNA-staal wordt in kleine stukjes verdeeld van werkbare grootte
vervolgens worden vectoren/genetisch gemodificeerde plasmiden en
gastheercellen worden gebruikt om DNA mengsel te fractioneren,
vermenigvuldigen en analyseren.
■ Transformatie van stukjes DNA,
via bv. elektroporatie = worden
elk afzonderlijk in cellen
(proces is dus selectief)
gebracht, vaak in snel delende cellen, bv. E. Coli
● Afzonderlijke cellen isoleren en cultiveren ⇒ DNA-opzuiveren
○ Vector
■ Bevat replicon-molecule dat er voor zorgt dat de DNA-sequentie kan
repliceren in de gastheer
■ Sommigen kunnen in een bacteriecel repliceren om hoge
kopie-aantallen te bereiken + bacterie die gekloond DNA bevat deelt
snel ⇒ groot aantal identieke bacterieklonen met elke vele vectoren
met vreemd DNA
■ Plasmiden als vector
● Niet essentiële DNA-moleculen die onafhankelijk van het
gastheerchromosoom repliceren
● Integreren niet in chromosoom gastheer = extrachromosomaal
● Meestal circulair
● Verschillenden kunnen naast elkaar bestaan
● Episomen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Bacteriofaag als vector
● Bestaan extracellulair maar hebben gastheer nodig om te
reproduceren ⇒ besmetting en lysis
● DNA/RNA genoom ingepakt in proteïne mantel
● Profagen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Genetisch gemodificatie is nodig, zodat we efficiënt een vreemd DNA
eraan kunnen verbinden en zodat getransformeerde cellen
gemakkelijker herkend worden
1
, Plaatsen van DNA stukje in vector
Gebruik van type 2 restrictie-nucleasen ⇒ knippen
DNA op plaatsen waar ze specifieke palindromen
(van 5 naar 3 leest hetzelfde als van 3 naar 5)
herkennen + zorgen voor uniforme uiteinden ⇒ kan
overhang (zie afbeelding, voordeel: ‘sticky ends’ =
door basenparing kunnen deze gemakkelijk opnieuw
verbonden worden door DNA-ligase ) of blunt zijn
● Natuurlijk doel = bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers, bv. bacteriofagen
● Plasmidevectoren bevatten klonering sites PL = opeenvolging van
restrictie-herkenningssequenties waar verschillende types nucleasen kunnen gaan
knippen ⇒ waar er geknipt is kan nu gemakkelijk een humaan stukje DNA gebracht
worden
○ Komen ook natuurlijk voor ⇒ natuurlijk doel
○ Bv. pUC19 ⇒ PL zit tussen LacI (repressor van Lacz’) en LacZ’, mechanisme om
te bepalen of er nu een humaan DNA stukje is opgenomen of niet
■ Werking:
- Bij toevoeging van IPTG aan non-recombinant DNA wordt LacI
geïnhibeerd en kan Lacz’ tot expressie komen ⇒ translatie tot
actief bèta-galactosidase ⇒ wanneer men dan X-gal toevoegt
aan de voedingsbodem, kleuren deze cellen blauw
- Recombinant DNA leidt niet tot expressie van Lacz’ ⇒ in
frame: te groot alfa-fragment waardoor inactief
bèta-galatosidase OF niet in frame waardoor ook inactief
Transformatie en fysiek scheiden van celkolonies
Op vector wordt antibioticum-resistentie gen geplaatst + transformatie in cellen die gevoelig
zijn voor antibioticum ⇒ cellen cultiveren op voedingsbodem met antibioticum waardoor
enkel de cellen met het recombinant DNA overleven. BELANGRIJK: mengsel goed
uitspreiden op petrischaal zodat kolonies, 1 kolonie groeit vanuit 1 cel elke cel heeft ander
ander DNA-fragment) goed verspreid zijn en dus makkelijk pikbaar zijn. Nu kan men uit
verschillende kolonies verschillende stukjes DNA opzuiveren.
⇒ Toepassingen
Aanmaak van genomische DNA-kloonbibliotheken
- Bevat verschillende DNA-klonen die tezamen alle verschillende DNA-sequenties in
het genoom omvatten.
2
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller EmilieFZ. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.37. You're not tied to anything after your purchase.
