Dit document bevat de volledige voorbereiding voor het practicum examen van celcultuur. Het bevat alle belangrijke theorie die tijdens de practica zijn overlopen en is dus 100% representatief!
DOEL: concentratie van 2 onbekende stalen (A en B) bepalen dmv van Enzym Immuno Assay (EIA)
EIA: competitief direct heterogeen systeem
- Competitief: eiwit (Ag) gaat in competitie met ander eiwit voor binding op Ab (kunnen beide binden)
- Direct: visualisatie van het eiwit gebeurt met 1 antilichaam
- Heterogeen: onbekende stalen bevatten versch. types eiwitten (Ag) waarvan 1 te onderscheiden is
ALGEMEEN: VISUALISATIE VAN HET GEBONDEN ANITGEN (EIWIT)
- Biotine-label toevoegen
- Complexvorming van het Ag met biotine: nog steeds niet waarneembaar
- Toevoegen van avidine biotine complex: ABC-complex bindt aan biotine
o Horse radish peroxidase (HRP = enzym dan aan ABC-complex is gebonden)
- Visualisatie gebeurt pas door toevoegen substraat: kleurt bauw (dankzij enzym op ABC-complex)
- De blauwe kleur is onstabiel, daarom toevoegen stop oplossing: blauw (instabiel) à geel (stabiel)
= DIRECT SYSTEEM
STAP 1: SPECIFIEK ANTILICHAAM BINDEN AAN DE PLAAT
- Onbekende A en B bevatten meerdere typen van eiwitten (heterogeen)
- Specifieke Ab gebruiken, waardoor slechts 1 type (gewenste antigen) eiwit hieraan zal binden
- Het Ag (eiwit) is gebonden aan het Ab, maar dit is nog niet waarneembaar
- Overmaat aan biotine toegevoegd aan Ag: zeker dat elk Ag een biotinelabel verkrijgt
- Overschot biotine kan interfereren met resultaten want kan nog steeds binden aan ABC-complex enz.
- Overmaat niet-gebonden biotine wordt weggehaald dmv gelfiltratie
Gelfiltratie: ontzoutingskolom gevuld met Sephadex korrels = scheiding o.b.v. grootte en moleculaire massa
- Grote gelabeld Ag dringt niet in de poreuze gel: kortere elutietijd, gaan als eerst uit de kolom
- Kleine ongebonden biotine dringen in de poreuze gel: langere elutietijd, komen trager uit kolom
Kalibratie van de kolom met BD-2000 (Blue Dextran)
- Biotine (gelabeld of ongelabeld) is kleurloos, daarom niet zichtbaar als het uit kolom loopt
- Blue Dextran heeft dezelfde moleculaire massa (grootte) als het biotine gelabeld Ag
- Doen er dus even lang over om door de kolom te lopen en komen in zelfde fractie terecht
Laat eerst het BD-2000 door de kolom laat lopen en vang deze fracties op. Zo weet je dat in de (meest) blauwe
fracties het BD-2000 zich bevindt. Wanneer je nu de antigen-biotine mengsel elueert, weet je in welke fracties
het gelabeld biotine terecht is gekomen (zelfde fracties als BD, want zelfde moleculaire massa)
STAP 3: CONCENTRATIE BEPALING VAN HET GEZUIVERD Ag-B
- Ijkcurve opstellen adhv verdunningen met BSA (bovine serum albumine, referentie-eiwit)
- Bradford reagens toegevoegd aan verdunningen: bindt aan eiwit (Ag) à blauwe kleur à OD bepaling
- Adhv ijkcurve kan concentratie Ag-B (conc. opgevangen fracties) bepaald worden (zie verslag)
STAP 4: COMPETITIE SYSTEEM (ZIE IN BUNDEL: STANDAARDCURVE MAKEN)
Probleem: we beginnen met een heterogeen complex, dus het andere type eiwit krijgt ook biotine label, dit
willen we niet. Hierdoor gaan we gebruik moeten maken van een competitie systeem
- Eigen onbekenden: niet biotinyleren
- Aparte stock van hetzelfde antigen (gekende conc.): wel biotinyleren! = controlegroep
- Controlegroep in competitie laten treden (=competitiesysteem)
Verdunningsreeks van ongelabeld antigen maken
Overal dezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toevoegen
- Daarnaast voeg je aan de 2 onbekende stalen diezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toe
- Voeg ABC-complex toe aan alle (gebruikte wells)
- Voeg vervolgens substraatoplossing toe: instabiele blauwe kleur à stop oplossing: stabiele gele kleur
Zie P15 bundel:
Gaat de eerste kolom donker of licht gekleurd zijn? Donker gekleurd (weinig licht doorgelaten, hoge OD) want
je hebt veel meer van uw ongelabeld Ag dan van uw gelabeld Ag. Het gelabelde Ag gaat bijna niet kunnen
binden aan het Ab. Hoe minder van het ongelabelde aanwezig (verdere kolommen (verdunningsreeks)), hoe
meer gelabeld Ag aanwezig gaat zijn, hoe lichter gekleurd het eruit zal zien (meer licht doorgelaten).
Het competitief systeem is dus een omgekeerd systeem. Hoe meer onbekende (ongelabeld) je hebt, hoe
minder licht omdat je eigenlijk de plaatsen inpikt van het antigen met label.
- Concentratiebepaling door opstellen standaardcurve met gekende concentratie aan hetzelfde Ag
2
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller StudentBi0med. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.88. You're not tied to anything after your purchase.
