Summary
Samenvatting per leerdoel Genetica en Evolutie Psychobiologie jaar 1
- Course
- Institution
Dit is een samenvatting voor genetica en evolutie gebaseerd op alle leerdoelen die op canvas gespecificeerd staan voor dit tentamen.
[Show more]
Seller
Follow
sennasie
Content preview
GEN-ISOLATIE EN GENETISCHE MANIPULATIE (HC9, H10)Leerdoelen
- Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken en strategieën formuleren om
onderzoekshypotheses te testen:
o DNA-extractie
o mRNA-extractie
o cDNA-productie
o PCR
o Gelelektroforese
o Restrictie-enzymen
o Ligatie
o Kloneren/transfectie
o Sequencing
o Microarray (h 14, maar zie ook Array CGH h17 (al behandeld) )
o CRISPR/Cas9
o Transgene dieren (boek)
DNA-extractie
1) Cellen verzamelen
2) Cellen kapot maken
o Lysisbuffer + warm waterbad cel- & kernmembraan gaan kapot, histonen
gaan kapot zodat DNA vrijkomt.
3) DNA scheiden van proteïnes etc.
o Geconcentreerde zoutoplossing proteïnes etc. klonteren samen
o Centrifuge proteïnes etc. zinken naar de bodem
o Overgebleven DNA-oplossing in ander epje.
4) Geconcentreerd DNA isoleren
o Isopropyl alcohol DNA klontert samen
o Centrifuge DNA zakt naar de bodem
o Verwijder overgebleven oplossing en laat DNA drogen
cDNA-productie
Stappen
1) Isoleer mRNA uit weefsel dmv van vissen met poly-T staart (mRNA-extractie).
2) cDNA productie dmv reverse transcriptase
o Primer (oligo dT) bindt aan mRNA template
o Reverse transcriptase complementaire DNA-streng
o RNase afbraak mRNA
o Oligonucleotide bindt aan ‘3 kant van cDNA
o DNA-ploymerase I en dNTP’s verlengen tot dubbelstrengs DNA
3)
,PCR
Benodigdheden
- Buffer (pH, zout, Mg2+)
- Template DNA (dubbelstrengs DNA dat target regio bevat)
- Primers (korte stukjes enkelstrengs DNA)
o Forward primer bindt aan onderste streng, leest 5’ – 3’.
o Reverse primer bindt aan bovenste streng.
o Primers zijn deel van het eindproduct.
o Lengte = 16-25 nucleotiden
- dNTP’s
- Taq-polymerase (hitte resistent)
Stappen
1) Denaturatie (95): waterstofbruggen breken enkelstrengs DNA
2) Annealing (45-70): primers binden aan complementaire sequenties
3) Elongation (72): Taq-polymerase start DNA-synthese vanaf primers
Agarose gelelektroforese
DNA is negatief geladen.
Gebruik
Grote mutaties
- Deletie of duplicatie > 50 bp
Kleine mutaties
- SNP, insertie of deletie
- Ontwikkel een selectieve primer
o WT geen PCR-product
o M wel PCR-product
Kloneren en transfectie dmv vectoren
Transfectie = construct in expressie systeem brengen
- Methode 1: PCR-producten met sticky-ends, primer bevat restriction site.
- Methode 2: Linkers, stukjes DNA met restriction site worden aan DNA geplakt.
Vector = artificieel construct dat vreemd DNA de cel in brengt (bijv. plasmide)
Een insert in een vector kloneren
- Restrictie-enzymen knippen specifieke DNA-sequenties in…
o insert-DNA sticky-ends
o vector-DNA sticky ends
- Ligase plakt twee DNA-fragmenten aan elkaar door fosfordiester-bindingen te
katalyseren.
, Sequencing
Voordelen:
- Slechts 1 reactie
- Langere reads mogelijk
Sanger sequencing
- Gemodificeerde basen
- Slechte kwaliteit: 15-40 & 700-900+
Microarray (H14)
Waarom?
Verschil in genexpressie tussen twee verschillende cellen meten.
Stappen
1) mRNA-isolatie dmv poly-T staarten
2) cDNA-productie met gelabelde nucleotiden
3) Microarray hybridisatie (vorming bindingen tussen complementaire strengen)
o Microarray plaatje bevat in elk putje een cDNA-streng die complementair is
aan de mogelijk aan te treffen cDNA’s.
4) Level hybridisatie berekenen (door computer)
o Wit = genexpressie van gen beide soort cellen
o Rood = meer genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Groen = minder genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Geen kleur = geen genexpressie van dit gen
Kan niet:
- Laten zien welke genen slecht zijn (of ziektes veroorzaken).
- Ziektes genezen.
- Alle niet-juist werkende genen identificeren.
RT-qPCR = hoeveelheid RNA in weefsel kwantificeren
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sennasie. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.95. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
64438 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now