SDS-Page en Blotten
Anton Martens en Ayoub Radi
3 CB
2021-2022
,Anton Martens, Ayoub radi Uitvoering labo: 8/11/2021
Inhoudsopgave
1. Inleiding..................................................................................................................................................... 2
2. Werkwijze:................................................................................................................................................. 3
2.1 SDS-page........................................................................................................................................................3
2.1.1 Bereiding en gieten gels.........................................................................................................................3
2.1.2 Bereiding elektroforesemonsters...........................................................................................................4
2.1.3 Laden van de gels....................................................................................................................................4
2.1.4 Uitvoering Elektroforese.........................................................................................................................5
2.1.5 Fixeren en kleuren van de gels...............................................................................................................5
2.2 Blotten............................................................................................................................................................6
2.2.1 Bereiding oplossingen en uitvoering blotting.........................................................................................6
2.2.2 Fixeren en kleuren gel en membraan.....................................................................................................7
3. Resultaten................................................................................................................................................. 8
4. Verwerking van de resultaten................................................................................................................... 10
5. Bespreking............................................................................................................................................... 13
6. Besluit...................................................................................................................................................... 13
7. Vragen..................................................................................................................................................... 14
8. Bibliografie.............................................................................................................................................. 15
1
, Anton Martens, Ayoub radi Uitvoering labo: 8/11/2021
1. Inleiding
Elektroforese is een techniek waarbij geladen deeltjes gescheiden worden door ze in een elektrisch
veld aan te brengen. Bij deze techniek worden de deeltjes gemigreerd over een inerte drager zoals
papier, cellulose-acetaat of gels. Positief geladen deeltjes migreren naar de kathode en negatieve
deeltjes migreren naar de anode met een bepaalde migratiesnelheid. Bij gelelektroforese heeft de
grootte van de deeltje een invloed op de migratiesnelheid. Hoe kleiner de diameter van het deeltje,
hoe groter zijn lading zal zijn en hoe groter de migratiesnelheid.
SDS-PAGE staat voor sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese waarbij de
polyacrylamidegel wordt verkregen door co-polymerisatie van acrylamide en N,N’-
methylbisacrylamide. Voor deze radicaal-polymerisatie is er een initiator en een katalysator nodig.
Als initiator maakt men gebruik van APS (ammoniumpersulfaat) voor de katalysator wordt TEMED
(N,N,N’ ,N’-tetramethyleendiamine) gebruikt.
Een gel wordt gekarakteriseerd door twee parameters, de dichtheid (%T) en de polymerisatiegraad
(%C). Deze kunnen berekend worden door volgende formules:
AA ( g )+ BAA (g)
%T = ∗100
Volume(mL )
BAA (g)
%C= ∗100
AA ( g )+ BAA ( g)
Als in een polyacrylamidegel elektroforese op uitgevoerd wordt, worden de deeltjes gescheiden op
basis van hun vorm, grootte en lading. Via PAGE kunnen eiwitten met een verschillende grootte en
lading gescheiden worden maar het bekomen elektroforegram geeft weinig informatie over de
grootte van de eiwitten. Via SDS-PAGE worden de eiwitten uitsluitend gescheiden op basis van hun
grootte, de eiwitten worden gedenatureerd. Voor het denatureren van de eiwitten wordt gebruik
gemaakt van een reductans die de disulfidebruggen verbreekt met als gevolg dat de geplooide vorm
van het eiwit wordt omgevormd tot een lineaire structuur. Wanneer de eiwitten gereduceerd en
ontrold zijn, hebben ze allemaal dezelfde vorm en lading per massa-eenheid en wordt er dus enkel
gescheden op basis van grootte.
Er wordt gebruik gemaakt van 4 standaard-referentie eiwitten namelijk: lysozyme, trypsinogeen (dit
eiwit was niet meer aanwezig en werd vervangen door albumine egg), albumine egg en albumine
bovine. Er worden ook 2 eiwitten gebruikt die als onbekende worden gezien namelijk: isocitraat
dehydrogenase en lactaat dehydrogenase.
Er kan een ijklijn opgesteld worden aan de hand van de gekende moleculaire massa van de
referentie-eiwitten (Y-as) en hun migratieafstand (X-as). Uit de vergelijking van de ijklijn kan dan de
moleculaire massa van de twee onbekende eiwitten bepaald worden.
Bij het tweede deel van de proef worden de eiwitten geblot. Blotten is het overbrengen van eiwitten
of nucleïnezuren van een gel op een membraan. In dit geval zullen de eiwitten overgebracht worden
van een agarose gel op een nitrocellulosemembraan.
Uit al de blottingstechnieken wordt tijdens deze proef elektro-blotting toegepast. Hierbij wordt met
behulp van een elektrisch veld de eiwitten overgebracht van de gel naar het membraan. De
veldsterkte die nodig is wordt bepaald door de grootte van de te transporteren moleculen. Een
2
Anton Martens en Ayoub Radi
3 CB
2021-2022
,Anton Martens, Ayoub radi Uitvoering labo: 8/11/2021
Inhoudsopgave
1. Inleiding..................................................................................................................................................... 2
2. Werkwijze:................................................................................................................................................. 3
2.1 SDS-page........................................................................................................................................................3
2.1.1 Bereiding en gieten gels.........................................................................................................................3
2.1.2 Bereiding elektroforesemonsters...........................................................................................................4
2.1.3 Laden van de gels....................................................................................................................................4
2.1.4 Uitvoering Elektroforese.........................................................................................................................5
2.1.5 Fixeren en kleuren van de gels...............................................................................................................5
2.2 Blotten............................................................................................................................................................6
2.2.1 Bereiding oplossingen en uitvoering blotting.........................................................................................6
2.2.2 Fixeren en kleuren gel en membraan.....................................................................................................7
3. Resultaten................................................................................................................................................. 8
4. Verwerking van de resultaten................................................................................................................... 10
5. Bespreking............................................................................................................................................... 13
6. Besluit...................................................................................................................................................... 13
7. Vragen..................................................................................................................................................... 14
8. Bibliografie.............................................................................................................................................. 15
1
, Anton Martens, Ayoub radi Uitvoering labo: 8/11/2021
1. Inleiding
Elektroforese is een techniek waarbij geladen deeltjes gescheiden worden door ze in een elektrisch
veld aan te brengen. Bij deze techniek worden de deeltjes gemigreerd over een inerte drager zoals
papier, cellulose-acetaat of gels. Positief geladen deeltjes migreren naar de kathode en negatieve
deeltjes migreren naar de anode met een bepaalde migratiesnelheid. Bij gelelektroforese heeft de
grootte van de deeltje een invloed op de migratiesnelheid. Hoe kleiner de diameter van het deeltje,
hoe groter zijn lading zal zijn en hoe groter de migratiesnelheid.
SDS-PAGE staat voor sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese waarbij de
polyacrylamidegel wordt verkregen door co-polymerisatie van acrylamide en N,N’-
methylbisacrylamide. Voor deze radicaal-polymerisatie is er een initiator en een katalysator nodig.
Als initiator maakt men gebruik van APS (ammoniumpersulfaat) voor de katalysator wordt TEMED
(N,N,N’ ,N’-tetramethyleendiamine) gebruikt.
Een gel wordt gekarakteriseerd door twee parameters, de dichtheid (%T) en de polymerisatiegraad
(%C). Deze kunnen berekend worden door volgende formules:
AA ( g )+ BAA (g)
%T = ∗100
Volume(mL )
BAA (g)
%C= ∗100
AA ( g )+ BAA ( g)
Als in een polyacrylamidegel elektroforese op uitgevoerd wordt, worden de deeltjes gescheiden op
basis van hun vorm, grootte en lading. Via PAGE kunnen eiwitten met een verschillende grootte en
lading gescheiden worden maar het bekomen elektroforegram geeft weinig informatie over de
grootte van de eiwitten. Via SDS-PAGE worden de eiwitten uitsluitend gescheiden op basis van hun
grootte, de eiwitten worden gedenatureerd. Voor het denatureren van de eiwitten wordt gebruik
gemaakt van een reductans die de disulfidebruggen verbreekt met als gevolg dat de geplooide vorm
van het eiwit wordt omgevormd tot een lineaire structuur. Wanneer de eiwitten gereduceerd en
ontrold zijn, hebben ze allemaal dezelfde vorm en lading per massa-eenheid en wordt er dus enkel
gescheden op basis van grootte.
Er wordt gebruik gemaakt van 4 standaard-referentie eiwitten namelijk: lysozyme, trypsinogeen (dit
eiwit was niet meer aanwezig en werd vervangen door albumine egg), albumine egg en albumine
bovine. Er worden ook 2 eiwitten gebruikt die als onbekende worden gezien namelijk: isocitraat
dehydrogenase en lactaat dehydrogenase.
Er kan een ijklijn opgesteld worden aan de hand van de gekende moleculaire massa van de
referentie-eiwitten (Y-as) en hun migratieafstand (X-as). Uit de vergelijking van de ijklijn kan dan de
moleculaire massa van de twee onbekende eiwitten bepaald worden.
Bij het tweede deel van de proef worden de eiwitten geblot. Blotten is het overbrengen van eiwitten
of nucleïnezuren van een gel op een membraan. In dit geval zullen de eiwitten overgebracht worden
van een agarose gel op een nitrocellulosemembraan.
Uit al de blottingstechnieken wordt tijdens deze proef elektro-blotting toegepast. Hierbij wordt met
behulp van een elektrisch veld de eiwitten overgebracht van de gel naar het membraan. De
veldsterkte die nodig is wordt bepaald door de grootte van de te transporteren moleculen. Een
2
